专利名称：用于检测马梨形虫的试剂盒及制备与使用方法
技术领域：
本发明涉及一种动物寄生虫的分子生物学鉴别检测技术，确切地讲本发明提供一种用于鉴别诊断马属动物是否感染梨形虫病的检测试剂盒及其制备与使用方法。
背景技术：
马梨形虫病(equine piroplasmosis)是驽巴贝斯虫和马泰勒虫寄生于马属动物(马、驴、骡和斑马)的红细胞内所引起一种急性、亚急性或慢性的原虫性寄生虫病，其传播媒介是蜱，主要以引起动物发热(有时呈周期性)、贫血、黄疽、肝脾肿大为特点，病程后期动物常出现胆红素尿和血红蛋白尿等症状。驽巴贝斯虫(Babesia cabalIi Nutall etStrickland, 1910)(旧名马焦虫，proplasma cabalIi)是原生生物界(Protista)的原生动物亚界(Protozoa)、顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoea)、梨形虫亚纲(Piroplasmia)、梨形虫目(Piroplasmida)中的巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属 (Babesia)的一个成员。驽巴贝斯虫寄生于马属动物的红细胞内，所引起的疾病称为驽巴贝斯虫病。马泰勒虫(Theileria equi Mehlhorn，Schein 1998)(旧名纳氏焦虫)是梨形虫亚纲(Piroplasmia)、梨形虫目(Piroplasmida)中的泰勒科(Theileriidae)、泰勒虫属(Theileria)的一个新成员(旧名马巴贝斯虫(Babesia equi Laveran，1901)，原来属于巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)的成员)，参见 Mehlhorn，H.，Schein, E.， 1998. Redescription of Babesia equi Laveran. 1901as Theileria equi. Parasitol. Res. 84,467-475.。马泰勒虫可寄生于马属动物(包括马、驴、骡和斑马)的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，所引起的寄生虫病称为马泰勒虫病。马梨形虫病在世界许多国家和地区流行，国际兽疫局(Office International Des Epizooties, ΟΙΕ)将马梨形虫病列为B 类疫病(OIE. Equine piroplasmosis. 2008)，我国将其列为二类疫病。在我国，驽巴贝斯虫病主要流行于东北、内蒙古东部、青海及新疆等地，其主要的传播媒介是革蜱属的草原革蜱、森林革蜱、银盾革蜱、中华革蜱。马泰勒虫病主要流行于新疆、内蒙古西部及南方各省， 其主要的传播媒介是革蜱属和扇头蜱属的蜱包括草原革蜱、森林革蜱、银盾革蜱、镰形扇头蜱等。(汪明主编.兽医寄生虫学[M].北京中国农业出版社，2008:366-369)。马梨形虫病的季节流行性很强，多呈急性经过，发病率和死亡率均很高，尤其对引进疫区的外来马属动物、纯种马以及杂交马的危害极大，是制约发展中国家马属动物养殖产业发展的主要疾病之一。目前，马梨形虫病的检测和诊断主要有下列几类手段(1)血涂片染色显微镜检测、淋巴结穿刺试验、体外培养、临床诊断和动物接种试验等传统方法，此类方法检出率低，对检测人员的素质要求非常高。( 血清学方法，如补体结合试验(CFT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)等，参见 Donnelly, J. , Phipps, L. P. , ffatkins, K. L. , 1982. Evidence of maternal antibodies to Babesia equi and B. cabalIi in foals of seropositive mares. Equine Vet. J. 14, 126-128. ；ffeiland,G.,Aicher,B. M. ,Boch,J. ,1984. Serodiagnosis and therapy control of equinepiroplasmosis by CFT and IFAT.Berl. Munch. Tierarztl. ffochenschr. 97,34134-34139. ；Knowles Jr.，D. P. ,PerrymaniL. E. ,Goff,W. L. ,MilleriC. D.，Harrington， R. D. ,Gorham,J. R. ,1991. A monoclonal antibody defines a geographically conserved surface proteinepitope of Babesia equi merozoites. Infect. Immun. 59,2412-2417.； Bose ,Rm，Jorgensen，W. K.，Dalgliesh，R. J.，Friedhoff，K. Τ.，de Vos，A. J.，1995. Current stateand future trends in the diagnosis of babesiosis. Vet. Parasitol. 57,61-74.； Briining，A.，Phipps，P.，Posnett，E.，Canning，E. U.，1997. Monoclonal antibodies agalnstBabesia cabalIi and Babesia equi and their application in serodiagnosis. Vet. Parasitol. 68，11-26. ；Kappmeyer, L. S.，Perryman, L. Ε.，Hines，S. Α.，Baszler, Τ. V.，Katz, J. B.，Hennager, S. G.，Knowles，D. P.，1999. Detection of equine antibodies toBabesia caballi by recombinant B.cabalIi rhoptry-associated protein Iin acompetitive-inhibition enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 37, 2285-2290.。此类方法虽然能诊断和鉴别驽巴贝斯虫病和马泰勒虫病，但是梨形虫的感染与相应抗体的出现不同步，可能会出现漏检、假阳性等现象，而且这类方法对检测人员的要求也很高。(3)分子检测技术，如PCR、巢氏PCR技术、多重PCR和LAMP等方法，具体参见 BASHIRUDDIN J. B.，CAMMA C. &REBEL0 E. (1999). Molecular detection of Babesia equiand Babesia caballi in horse blood by PCR amplification of part of the 16S rRNA gene. Vet. Parasitol.，84，75-83 ；SAHA⑶N-RUIZ Α.，WAGNELA S. D.，HOLMAN P. J.， CHIEVESL. P. &WAGNER G. G. (1997).。与常规的方法相比，此类方法具有敏感性高、特异性强、检出率高等优点，但是它们都只针对马梨形虫的特异性基因进行检测，对于目的基因中引物结合关键位点上发生变异的虫种(株)和一些未知梨形虫虫种(株)却无能为力。所以目前需要研制出一种既能检测出梨形虫的通用方法，又可以鉴别和区分感染马属动物的梨形虫的具体种类，还能检测出感染马属动物的的梨形虫新种(株)的通用检测方法，这在马梨形虫病的诊断、治疗、防控和流行病学调查等方面有重要的意义。
发明内容
本发明提供一种用于检测马梨形虫的试剂盒及其制备与使用方法。本发明的检测马梨形虫试剂盒内有检测马梨形虫的检测膜和梨形虫通用引物，其中检测马梨形虫的检测膜是在Biodyne C膜的不同区域分别固定有如下述的五种核苷酸序列的探针梨形虫通用探针(C-all)CTGTCAGAGGTGAAATTCT；巴贝斯虫通用探针(B-all)CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA ；驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT ；泰勒虫通用探针(T-all)WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；马勒虫特异探针(T-equi)TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA；以上序列中的R、W或V是兼并碱基，其中1 =八或6;1 =八或11;￥ =八或(或6梨形虫通用引物为上游弓丨物 RLB-F (5，-gaggtagtgacaagaaataacaata-3，)；字弓L RLB-R (biotin-5' -tcttcgatcccctaactttc-3')。
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本发明的用于检测马梨形虫的试剂盒中的检测膜制备方法是1)首先人工合成如下五种核苷酸序列梨形虫通用探针(C-all)CTGTCAGAGGTGAAATTCT；巴贝斯虫通用探针(B-all)CCTTRGTAATGGTTAATAGGAA ；驽巴贝斯虫特异探针(B-cab)AAACCCTCGCCAGAGTAACAATT ；泰勒虫通用探针(T-all)WVCCRRAGTAATGGTTAATAGG；马勒虫特异探针(T-equi)TTTTAGGAGCCRGAGTAATGGTTA，将上述各序列的5’端用氨基团进行修饰后待用，2)将各核酸探针按下述用量稀释于150 μ L的pH 8. 4的500mM NaHCO3中待用梨形虫通用探针(C-all) 5p 50p mol ；巴贝斯虫通用探针(B_all) 12p IOOp mol ；驽巴贝斯虫特异探针(B-cab) 50p IOOp mol ；泰勒虫通用探针(T_all)50p IOOp mol ；马勒虫特异探针(T-equi)lOp IOOp mol ；3)将Biodyne C膜剪成预定的尺寸并标记顺序后用去离子水配制IOmL新鲜的 16% (w/v)的EDAC溶液，将前述Biodyne C膜放在盛有16%的EDAC溶液的容器内，在室温下不断地旋转容器，进行孵育、活化处理；将活化的Biodyne C膜用去离子水漂洗2后放入洁净的印迹仪内并除去印迹仪孔槽中残留的液体；4)将150yL稀释好的各探针溶液分别加入印迹仪的目标孔槽中，其中第一个和最后一个孔不加探针，用2XSSPE将墨水稀释后加入第一个孔和最后一个孔，未加探针的多余孔槽用2 X SSPE缓冲液填充，再在室温条件下孵育2分钟后除去各个孔槽内的液体，所用的2 X SSPE缓冲液为ρΗ7· 4，用0. 2Μ Na2HPO4,、3. OM NaCl和20mM EDTA配制而成；将经前处理的膜用新鲜配制250mL的IOOmM NaOH溶液孵育膜10分钟，使Biodyne C膜钝化后再用去离子水漂洗；5)用250mL的2X SSPE/0. 1 % SDS缓冲液在60°C温度条件下漂洗经前处理的膜， 再用IOOmL 20mM pH 8. 0的EDTA溶液在室温条件下，漂洗膜，再将该Biodyne C膜在4°C条件下密封保存直至使用。本发明的试剂盒的使用方法是从待检马属动物的血液中提取基因组DNA为模板，用梨形虫通用引物进行PCR扩增，将其扩增产物变性后与检测膜上的探针进行杂交， 与探针发生特异性结合的PCR产物末端的生物素与链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(str印tavidin-peroxidase)作用后，能催化过氧化物酶的底物增强化学发光氨试剂 (ECL-detection)发出荧光，使X感光胶片曝光；胶片经显影和定影处理后，与检测膜上探针与PCR产物发生特异性杂交的相对应的区域出现阴影，根据胶片上有无留下阴影来判断被检动物是否有患有梨形虫病。为便于鉴别检测工作，本发明的试剂盒内最好还有如下内容a)标准马泰勒虫阳性的动物基因组DNA ；b)标准驽巴贝斯虫阳性的动物基因组DNA ；c)标准马梨形虫阴性的马基因组DNA ；d)标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA ；e)灭菌超纯水；本发明实际上是采用反向线性印迹微量检测技术(reverse lineblottingmacroarrays)，是以多个梨形虫虫种18S rRNA基因序列(包括国内流行的驽巴贝斯虫株和马泰勒虫株)的V4高变区为目标设计的一种检测和鉴别马梨形虫的方法。采用本发明的方法鉴别诊断马梨形虫时有五大优点第一、在本发明的检测膜上不同区域内同时固定有驽巴贝斯虫特异性DNA探针和马泰勒虫特异性DNA探针，所以采用本发明的检测膜不但可以很方便地鉴别驽巴贝斯虫和马泰勒虫，还可以检测出二者混合感染情况(如图5所示)，这对于马属动物群发性梨形虫病的流行病调查有重要的意义。第二、由于在本发明的检测膜上还固定有梨形虫通用DNA探针、巴贝斯虫通用DNA 探针和泰勒虫通用DNA探针，所以本发明检测膜上的探针不但可以对多种梨形虫的进行检测和分类，扩大检测范围，还可以利用该方法发现感染马属动物的梨形虫新种(未知种或株)。第三、利用本发明的检测膜检测的敏感性和特异性高于普通检测方法和常规PCR 方法，有利于马梨形虫病的早期检测和低染虫率的梨形虫病例的检测，及时采取措施进行防控。第四、在具体实施本发明时，以被检动物的血液基因组DNA为模板，只用一对梨形虫通用引物，经一次PCR扩增，如果PCR产物经电泳检测呈阳性就能确定被检动物感染了梨形虫病；PCR产物再经检测膜进一步检测后，还能确定所感染的梨形虫的具体种类、混合感染等情况，这为梨形虫病的快速检测、虫种鉴定和流行病学调查提供了重要的工具。第五、采用本发明的检测膜时进行检测时，可对45个样品同时进行检测，而并不明显增加检测时所用的时间；而且检测膜上与探针杂交的PCR产物很容易洗脱除去，而探针仍然留在检测膜上，检测膜的检测特性不发生改变，所以检测膜可以反复用于检测；且检测膜密封后在4°C条件下能长期保存，检测方法相对简单，检测过程耗时较少，成本低廉。这在进行较大规模、长周期的马梨形虫病流行病学调查时有极大的优势，能节约时间，节省大量的人力物力。
图1为本发明实施例的检测膜上固定的五种探针的位置和分布模式示意图，其中竖排如图所示的长条形区域从左边起第一排和最后一排用墨水作标记，第2 6排的相应区域分别固定五种DNA探针，其中竖排标记的Ca对应于梨形虫通用DNA探针C_all，Ba对应于巴贝斯虫通用DNA探针B-all，Bc对应于驽巴贝斯虫特异性DNA探针B_cab，I1a对应于泰勒虫通用DNA探针T-all，Te对应于马泰勒虫特异性DNA探针T_equi。图2为PCR产物与检测膜上的探针杂交模式图。其中检测膜上竖排标注的探针名称与图1中一致。利用印迹仪在检测膜上从上到下的每一个横排的长条形区域内，添加一个来源于被检动物基因组DNA为模板进行PCR扩增后经稀释和变性处理过的PCR产物样品，即可与检测膜上的五种探针同时进行杂交，一张14cmX 14cm正方形大小的检测膜能同时检测45个样品。图3为用于检测马梨形虫的试剂盒内的检测膜对14种梨形虫的标准样品检测模拟图。检测膜上竖排固定的探针标注名称与图1中一致，其中竖排标记的Ca对应于梨形虫通用DNA探针C-all，Ba对应于巴贝斯虫通用DNA探针B_all，Bc对应于驽巴贝斯虫特异性DNA探针B-cab，Ta对应于泰勒虫通用DNA探针T_all，Te对应于马泰勒虫特异性 DNA探针T-equi。横排标注的是PCR产物加样顺序及其模板来源，14种梨形虫的标准样品、一份混合感染样品、两份阴性对照和一份空白对照分别对应位置是1、大巴贝斯虫，2、 牛巴贝斯虫，3、牛巴贝斯虫未定种，4、卵形大巴贝斯虫，5、双芽大巴贝斯虫，6、莫氏巴贝斯虫，7、驽巴贝斯虫，8、马泰勒虫，9、环形泰勒虫，10、瑟氏泰勒虫，11、中华泰勒虫，12、羊泰勒虫，13、尤氏泰勒虫，14、吕氏泰勒虫，15、驽巴贝斯虫/马泰勒虫混合感染样品，16、阴性对照(马基因组DNA)，17、阴性对照(驴基因组DNA)，18、空白对照(水)。经序列分析预期检测为阳性在图中用黑色小方块标出，杂交过的检测膜与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(str印tavidin-peroxidase)作用后，黑色小方块区域内结合的过氧化物酶能催化底物——增强化学发光试剂(ECL-detection)发生化学反应，同时发出的荧光能使X感光胶片对应区域曝光。图4为用梨形虫通用引物对14个梨形虫虫种基因组DNA标准样品进行PCR扩增后的电泳检测的结果。图中M是DNA分子标准DL5000DNA Marker, 1 18道PCR产物对就应的模板分别为1、大巴贝斯虫，2、牛巴贝斯虫，3、牛巴贝斯虫未定种，4、卵形大巴贝斯虫，5、双芽大巴贝斯虫，6、莫氏巴贝斯虫，7、驽巴贝斯虫，8、马泰勒虫，9、环形泰勒虫，10、瑟氏泰勒虫，11、中华泰勒虫，12、羊泰勒虫，13、尤氏泰勒虫，14、吕氏泰勒虫，15、驽巴贝斯虫/ 马泰勒虫混合感染样品，16、阴性对照(马基因组DNA)，17、阴性对照(驴基因组DNA)，18空白对照(水)图5为用检测膜对驽巴贝斯虫、马泰勒虫等14种梨形虫基因组DNA标准样品进行检测后X感光胶片显影的结果扫描截图。图5与图3的左上角PCR与探针杂交的区域相对应，也就是说与预期结果一致。图5中竖排标注的是与检测膜上对应的核酸探针名称与图1中一致；横排所标出的是与检测膜上探针杂交的PCR产物的模板来源，左侧标出的是中文名称，右侧标出的是对应的英文名称，左右对应一致。胶片上出现的小的类正方形的黑色区域表示检测结果呈阳性，其对应的检测膜上的探针和相应的PCR产物发生了特异性杂交。没有出现阴影的区域表示检测结果呈阴性，即表示PCR产物没有与探针发生特异性结合。阴性对照和空白对照均没有出现阴影，且14种梨形虫的检测结果都与预期结果一致， 说明检测系统正常。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例。一、用于检测马梨形虫的检测膜的制备过程基于梨形虫通用引物(RLB-F/RLB-R)扩增的目的基因——梨形虫18S rRNA基因V4高变区序列，利用专业软件分别设计了梨形虫的通用DNA探针、属特异性DNA探针O 种)、种特异性DNA探针O种)。探针经人工合成后并用氨基团修饰的核酸探针能够共价结合到带负电荷的尼龙膜(Β οο!Υηθ (:，0.45μπι)膜上。具体操作程序如下1、用于检测马梨形虫的特异性DNA探针的合成与修饰按表1中所述分别合成梨形虫的通用DNA探针C-all、巴贝斯虫通用DNA探针 B-all、泰勒虫通用DNA探针T_all、驽巴贝斯虫特异性DNA探针B_cab和马泰勒虫特异性DNA探针T-equi，并将这五种DNA核酸探针5，端碱基上C6位置分别用氨基团N_(trifluo roacetamidohexyl-cyanoethyl, N, N-diisopropyl phosphoramidite[TFA])进行修饰。表1检测马梨形虫的检测膜上固定的探针名称、碱基序列和修饰方式及其用量
权利要求
1.用于检测马梨形虫的试剂盒，其特征是试剂盒内有检测马梨形虫的检测膜和梨形虫通用引物，其中检测马梨形虫的检测膜是在Biodyne C膜的不同区域分别固定有如下述的五种核苷酸序列的探针梨形虫通用探针(c-aiDctgtcagaggtgaaattct ； 巴贝斯虫通用探针(B-aiDccttrgtaatggttaataggaa ； 驽巴贝斯虫特异探针(b-cab) aaaccctcgccagagtaacaatt ； 泰勒虫通用探针(τ-aiDwvccrragtaatggttaatagg ； 马勒虫特异探针(t-equi)ttttaggagccrgagtaatggtta ；以上序列中的R、W或V是兼并碱基，其中1 =八或6;1 =八或11;￥ =八或(或6; 梨形虫通用引物为上游弓丨物 RLB-F (5，-gaggtagtgacaagaaataacaata-3，)； 字弓L RLB-R (biotin-5' -tcttcgatcccctaactttc-3')。
2.权利要求1所述的用于检测马梨形虫的试剂盒中的检测膜制备方法，其特征是人工合成如下五种核苷酸序列梨形虫通用探针(c-aiDctgtcagaggtgaaattct ； 巴贝斯虫通用探针(B-aiDccttrgtaatggttaataggaa ； 驽巴贝斯虫特异探针(b-cab) aaaccctcgccagagtaacaatt ； 泰勒虫通用探针(τ-aiDwvccrragtaatggttaatagg ； 马勒虫特异探针(τ-equi) ttttaggagccrgagtaatggtta, 将各序列的5'端用氨基团进行修饰后待用，1)将各核酸探针按下述用量稀释于150μ L的pH 8. 4的500mM NaHCO3中待用梨形虫通用探针(C-all)5 50p mol ；巴贝斯虫通用探针(B_all)12 IOOp mol ；驽巴贝斯虫特异探针(B-cab) 50 IOOp mol ；泰勒虫通用探针(T_all)50 IOOp mol ；马勒虫特异探针(T-equi) 10 IOOp mol ；2)将BiodyneC膜剪成预定的尺寸并标记方向和顺序后，用去离子水配制IOmL新鲜的16 % (w/v)的EDAC溶液，将前述Biodyne C膜放在盛有16 %的EDAC溶液的容器内，在室温下不断地旋转容器，进行孵育、活化处理；将活化的Biodyne C膜用去离子水漂洗2后放入洁净的印迹仪内并除去印迹仪孔槽中残留的液体；3)将150yL稀释好的各探针溶液分别加入印迹仪的目标孔槽中，其中第一个和最后一个孔不加探针，用2XSSPE将墨水稀释后加入第一个孔和最后一个孔，未加探针的多余孔槽用2 X SSPE缓冲液填充，再在室温条件下孵育2分钟后除去各个孔槽内的液体，所用的 2 X SSPE缓冲液为ρΗ7· 4，用0. 2Μ Na2HPO4,、3. OM NaCl和20mM EDTA配制而成；将经前处理的膜用新鲜配制250mL的IOOmM NaOH溶液孵育膜10分钟，使Biodyne C膜钝化后再用去离子水漂洗；4)用250mL的2XSSPE/0.1% SDS缓冲液在60°C温度条件下漂洗经前处理的膜，再用 IOOmL 20mM pH 8. 0的EDTA溶液在室温条件下，漂洗膜，再将该Biodyne C膜在4°C条件下密封保存直至使用。
3.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征是从待检马属动物的血液中提取基因组DNA，再用梨形虫通用引物进行PCR扩增，将扩增产物变性后与检测膜上的探针进行杂交，特异性结合在检测膜上的PCR产物末端的生物素与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(str印tavidin-peroxidase)作用后，能催化过氧化物酶的底物增强化学发光氨试剂 (ECL-detection)发出荧光，使X感光胶片曝光；胶片经显影和定影处理后，与检测膜上探针与PCR产物发生特异性杂交的相对应的区域出现阴影，根据胶片上有无留下阴影来判断被检动物是否有患有梨形虫病。
全文摘要
本发明公开一种用于鉴别诊断马属动物是否感染梨形虫病的检测试剂盒及其制备与使用方法。本发明的检测马梨形虫试剂盒内有检测马梨形虫的检测膜和梨形虫通用引物。本发明的试剂盒的使用方法是从待检马匹血液中提取DNA，再用梨形虫通用引物进行扩增，将扩增产物与检测膜结合，将PCR产物末端的生物素与链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase)作用后，能催化过氧化物酶的底物增强化学发光试剂(ECL-detection)发出荧光，使X感光胶片曝光；胶片经显影和定影处理后，与检测膜上探针与PCR产物发生特异性杂交的相对应的区域出现阴影，根据胶片上有无留下阴影来判断被检动物是否有患有梨形虫病。
文档编号C12Q1/04GK102181556SQ201110102050
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者刘光远, 田占成, 谢俊仁 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所