专利名称：一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物发酵制氢的方法，尤其是一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法。
背景技术：
生物制氢技术是一种利用产氢菌新陈代谢过程进行产氢的技术，是一种清洁、低能耗的制氢方法。目前国内外对发酵法产氢的研究主要包括两个方面一方面是纯菌株产氢的研究，为了获得高效产氢发酵细菌，国内外研究者分离了大量的产氢发酵细菌，分离的产氢发酵细菌多数集中在梭菌属和肠杆菌属。采用具有高效产氢能力的纯细菌，底物降解速度快，产氢速度快，底物的氢气转化率高，反应器可以在较高的负荷下运行。但纯菌种的分离和提纯技术条件苛刻且不易批量获得，而且纯菌种分离成本昂贵，在一定程度上妨碍了生物制氢反应器产氢效能的发挥。另一方面为混合菌种产氢的研究，即通过两种或两种以上的菌株相互协同作用发酵产氢，或者利用活性污泥发酵法产氢，混合菌种产氢通过菌种之间的相互作用提高了产氢的效率，在运行中方便操作和管理，因此大大提高了生物制氢技术工业化的可行性，也成为国际上近年来生物制氢技术研究的热点。通过对专利检索，目前对于混合菌产氢研究主要集中于活性污泥、活性污泥与高效产氢菌混合产氢，如一种污泥与有机垃圾混合生物制氢的方法(申请号200710032658. 0 周少奇等)，对于高效产氢菌之间的复配研究较少，有专利一种菌种复配降解纤维素发酵产氢的方法(申请号200710071696. 7王爱杰等)，一种由多菌株联合固态发酵秸秆制备氢气的方法(申请号01142220. 3李雪驼等)，但其主要为处理复杂废弃物，对于单一底物研究较少。因此，对高效复配产氢菌群基于葡萄糖基质的产氢研究很有必要。纯培养制氢技术已筛选出产氢效率较高的菌株，主要包括严格厌氧菌和兼性产氢菌，如严格厌氧菌Clostridiim sp.产氢能力为2molH2/mol葡萄糖，兼性产氢菌力acter 577.产氢能力为lmolH2/mol 葡萄糖的。但严格厌氧菌对氧气极为敏感，在微量氧气环境中生长和产氢能力均受到抑制， 兼性产氢菌则可以在微氧条件下具有较高活性并消耗培养基中氧气而达到厌氧环境。
发明内容
本发明目的是提供一种基于葡萄糖为基质的高效产氢菌复配产氢方案，并将其应用至长期连续发酵产氢该过程。利用兼性产氢菌与厌氧菌及两株厌氧菌之间的复配协同产氢，具有优于纯培养产氢菌的产氢特性，氢气产量提高。本发明的技术方案为一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法，使用兼性产氢菌与一种或两种厌氧产氢菌以同比接种于常规的产氢培养基中采用批式或连续发酵方法制氢，其中兼性产氢菌为产气肠杆菌Bacteria. Ε,厌氧产氢菌为丁酸梭菌Bacteria. B 或巴氏梭菌Bacteria. P。所述的产氢培养基的组成为牛肉膏5g/L、蛋白胨3g/L、NaC15g/L、FeS040.2 g/L、 K2HP042 g/L、蒸馏水lOOOmL，发酵底物为葡萄糖。
批式发酵方法制氢是以N2吹扫培养液5min，发酵过程pH保持6. (Γ7. 0，调节发酵罐搅拌速率200r/min，发酵温度37士 1°C，高浓菌液的接种量为培养基总体积的10%，葡萄糖的浓度为20g/L。连续发酵发酵方法制氢是将发酵底物葡萄糖以5g/h的恒定流速流加。兼性产氢菌Bacteria. E的高浓菌液采用常规方法为好氧培养，于37°C下，170r/ min振荡条件下培养M 48h ；厌氧产氢菌Bacteria. P和Bacteria. B高浓菌液采用常规方法厌氧培养以氮气吹扫培养液，于37°C下于厌氧培养箱静置培养12(Tl30h，高浓菌液的浓度均为 5X IO9 5X IO11 cell/ml。有益效果
兼性产氢菌Bacteria. E对环境具有良好的适应性，可以在微量氧气中具有良好的代谢能力，但其产氢量不高；厌氧产氢菌Bacteria. B, Bacteria. P产氢量较高，但对于产氢环境要求完全厌氧，在存在氧气条件下产氢活性降低，并且产氢启动时间和发酵周期长。利用兼性产氢菌与厌氧产氢菌进行复配产氢则可利用各自优点在环境中能够良好地共生，更利于氢气的产生，当批量制氢时，发酵周期24h时，单位底物氢气产量为1. 885molH2/mol葡萄糖，平均产氢速率为212. 20mL/ (h · L)；当采用连续制氢时，发酵底物葡萄糖以5g/h的恒定流速流加，当葡萄糖流加持续120h、累积葡萄糖添加量600g、发酵持续时间5天时，得到该条件下单位底物氢气产量为1. 968molH2/mol葡萄糖，平均产氢速率为185. 38mL/(L -h)。
图1批式发酵不同实施例动态产氢曲线。图2实施例五连续发酵动态产氢曲线。
具体实施方案
通过下面给出的实施例对具体发酵产氢进一步说明 按常规方法分别制备三株产氢菌的高浓菌液
兼性产氢菌Bacteria. E接种到牛肉膏蛋白胨培养液里，每升培养液含有蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，蒸馏水lOOOmL，并控制pH为6. (Γ7. 0，于37°C下，170r/min振荡条件下培养M 48h，得到高浓缩菌液。厌氧产氢菌Bacteria. P，Bacteria. B接种至培养液，培养基成分为蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g，L-半胱氨酸0. 5g/L，蒸馏水lOOOmL，并控制 PH为6 7，以氮气吹扫培养液，于37°C下于厌氧培养箱静置培养120h，得到相应的高浓缩菌液。高浓缩菌液中菌的含量均为5X IO9 5X IO11 cell/ml。产氢培养基配置
产氢培养基组成为牛肉膏 5g/L、蛋白胨 3g/L、NaC15g/L、FeS040. 2 g/L、K2HP042 g/L， 蒸馏水1000mL。实施例一
该实施例发酵方式为批式发酵，产氢培养基中加入底物葡萄糖，葡萄糖浓度为20g/L， 初始pH=6. 0 7. 0。于10L发酵罐中置入有效体积6L产氢培养基，进行115°C灭菌25min。 将制备的高浓菌液兼性产氢菌Bacteria. E与厌氧产氢菌Bacteria. P以1 1的比例接种至产氢培养基，高浓菌液的接种量为培养基总体积的10%，也就是高浓菌液的接种的体积为培养基体积的10%。发酵产氢工艺条件
以N2吹扫培养液5min，使发酵环境近于厌氧，在线监测发酵液相pH、温度、搅拌速率， 通过添加稀NaOH调节发酵过程pH保持6. (Γ7. 0，调节发酵罐搅拌速率200r/min，发酵温度 37 °C。分析方法
发酵罐气体出口接气体流量计，通过流量计计量累积气体产量，通过气相色谱TCD检测器分析吐体积分数。得到该实施方案条件下动态产氢曲线见说明书附图1，该实施例发酵产氢周期为 Mh，累积气体产量为39. 4L，发酵气相组成为氢气和二氧化碳两种气体，其中氢气体积分数为55. 50%，最终氢气产量为21. 9L ；该发酵过程平均产氢速率达183. 15mL/ (h *L)，液相中葡萄糖分解率为95. 10%，最终单位底物氢气产量为1. 704molH2/mol葡萄糖。实施例二 该实施例与实施例一不同之处在于复配方案为兼性产氢菌Bacteria. E与厌氧产氢菌Bacteria. B,高浓菌液接种比例为1 1，其余同实施例一。得到实施例二动态产氢曲线见说明书附图1，发酵产氢周期为Mh，累积气体产量为29. 3L，发酵气相组成为氢气和二氧化碳两种气体，其中氢气体积分数为54. 80%，最终累积氢气产量为16. IL ；该发酵过程平均产氢速率达167. 25mL/ (h *L)，液相中葡萄糖分解率为92. 00%，最终单位底物氢气产量为1. 290molH2/mol葡萄糖。实施例三将两株厌氧产氢菌Bacteria. P与Bacteria. B进行复配，高浓菌液以 1:1比例接种至产氢培养基，其余同实施例一。得到实施例三动态产氢曲线见说明书附图1，该实施例发酵产氢周期为50h，累积气体产量为33. 3L，发酵气相组成为氢气和二氧化碳两种气体，其中氢气体积分数为 60. 00%，最终累积氢气产量为20. OL ；该发酵过程平均产氢速率达86. 70mL/ (h *L)，液相中葡萄糖分解率为93. 00%，最终单位底物氢气产量为1. 604molH2/mol葡萄糖。相对于实施例一、实施例二，实施例三厌氧产氢菌复配发酵周期长，平均产氢速率低，但单位产氢量较实施例二高。实施例四三株产氢菌同比复配，将兼性产氢菌Bacteria. E与两株厌氧产氢菌 Bacteria. P与Bacteria. B的高浓菌液以体积比1:1:1比例接种于产氢培养基，接种量为培养基总体积的10%，其余同实施例一。得到实施例四动态产氢曲线见说明书附图1，该方案发酵产氢周期为Mh，累积气体产量为44. 0L，代谢气体组成为氢气和二氧化碳两种气体，其中氢气体积分数为56. 30%, 最终累积氢气产量为24. 8L ；该发酵过程平均产氢速率达212. 20mL/ (h *L)，液相中葡萄糖分解率为97. 10%，最终单位底物氢气产量为1. 885molH2/mol葡萄糖。实施例五比较实施例一、二、三、四，实施例四的三株产氢菌同比复配具有最佳产氢特性，并进一步将其应用至工业制氢，将三株产氢菌复配应用至连续发酵产氢。该实施例与实施例一不同之处在于
产氢菌株为三株产氢菌同比复配，将兼性产氢菌Bacteria. E与两株厌氧产氢菌 Bacteria. P与Bacteria. B高浓菌液以1:1:1比例接种于产氢培养基，接种量为培养基总体积的10%，其余同实施例一。 发酵产氢工艺该实施例发酵方式为连续发酵产氢，初始以队吹扫培养液5min， 使发酵环境近于厌氧，在线监测发酵液相PH、温度、搅拌速率，通过添加稀NaOH调节发酵过程PH保持6. (Γ7. 0，调节发酵罐搅拌速率200r/min，发酵温度37 °C。发酵底物葡萄糖以5g/ h的恒定流速流加，葡萄糖流加持续120h，累积葡萄糖添加量600g，发酵持续时间5天时，得到该实施例下动态产氢曲线见说明书附图2。该实施例连续发酵产氢5天，终端累积产气量为Ml. 4L，代谢气相由氢气和二氧化碳两种气体组成，其中氢气体积分数为55. 3%，累积氢气产量为133. 5L ；发酵过程底物以流加方式添加，平均产氢速率为185. 38mL/(L · h)，液相葡萄糖分解率为98. 90%，最终单位底物氢气产量为1. 968molH2/mol葡萄糖。该实施例连续发酵过程中产氢保持良好的产氢稳定性，而且对葡萄糖的利用率有所提高，宜应用于长期连续发酵产氢研究。
权利要求
1.一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法，其特征在于，使用兼性产氢菌与一种或两种厌氧产氢菌以同比接种于常规的产氢培养基中采用批式或连续发酵方法制氢，其中兼性产氢菌为产气肠杆菌Bacteria. Ε,厌氧产氢菌为丁酸梭菌Bacteria. B或巴氏梭菌 Bacteria. P0
2.根据权利要求1所述的一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法，其特征在于，所述的产氢培养基的组成为牛肉膏5g/L、蛋白胨3g/L、NaC15g/L、！^eSO4O. 2 g/L、 K2HP042 g/L、蒸馏水lOOOmL，发酵底物为葡萄糖。
3.根据权利要求1所述的一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法，其特征在于，批式发酵方法制氢是以N2吹扫培养液5min，发酵过程pH保持6. (Γ7. 0，调节发酵罐搅拌速率200r/min，发酵温度37士 1°C，高浓菌液的接种量为培养基总体积的10%，葡萄糖的浓度为20g/L。
4.根据权利要求1所述的一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法，其特征在于，连续发酵发酵方法制氢是将发酵底物葡萄糖以5g/h的恒定流速流加。
5.根据权利要求1所述的一种利用兼性产氢菌与厌氧菌复配制氢的方法，其特征在于，兼性产氢菌Bacteria. E的高浓菌液采用常规方法为好氧培养，于37°C下，170r/min振荡条件下培养24 48h ；厌氧产氢菌Bacteria. P和Bacteria. B高浓菌液采用常规方法厌氧培养以氮气吹扫培养液，于37°C下于厌氧培养箱静置培养12(Tl30h，高浓菌液的浓度为 5X IO9 5X IO11 cell/ml。
全文摘要
一种利用兼性产氢菌与厌氧产氢菌复配产氢的方法，采用了一株兼性产氢菌与两株厌氧菌于10L发酵罐以不同复配方案进行产氢。在批式发酵产氢工艺中，三组菌株组成四种复配方案，不同复配方案各菌株以同比混合，总接种浓度10%，得到兼性产氢菌与两厌氧菌共同混合方案具有最佳产氢特性，其发酵周期为24h，单位底物氢气产量为1.885molH2/mol葡萄糖，平均产氢速率为212.20mL/(h·L)；将批式发酵工艺下最佳复配方案应用至连续发酵工艺，葡萄糖以5g/h的恒定流速流加，流加持续120h，发酵培养5天，产氢连续稳定。
文档编号C12R1/01GK102199651SQ20111010178
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者袁晓明, 钱春香 申请人:东南大学