专利名称：一种兼性厌氧菌的筛选方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌筛选领域。更具体而言，本发明涉及兼性厌氧菌的筛选方法和装置。
背景技术：
细菌分为好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌等。兼性厌氧菌(facultative anaerobe)又称兼嫌气性微生物，兼嫌气菌、兼性好氧菌。在有氧或无氧环境中均能生长繁殖的微生物。 在有氧(O2)或缺氧条件下，可通过不同的氧化方式获得能量。相对于好氧菌或厌氧菌的筛选技术，兼性厌氧菌的筛选技术还不够完善、有效、成熟。传统的兼性厌氧菌筛选方法存在着较多的弊端，如所筛选得到的菌群中严格厌氧菌与兼性厌氧菌混杂(或严格好氧菌与兼性厌氧菌混杂)，筛选出的菌种类较少等缺陷。对兼性厌氧菌的筛选，传统上主要有以下方法(1)分别对好氧菌和厌氧菌进行鉴定，筛选出兼性厌氧菌；(2)在好氧条件下富集培养，分离出的细菌再用厌氧菌培养技术培养，能生长的即为兼性厌氧菌；(3)在厌氧条件下富集培养，分离出的细菌再用好氧培养技术培养，能生长的即为兼性厌氧菌。由于兼性厌氧菌既能存活于无氧条件，又能存活于有氧条件，因此它们对环境中氧化还原电位(Eh)的适应范围广。正是由于兼性厌氧菌的这种特性，对于溶解氧的变化范围大且以无氧区为主的环境，兼性厌氧菌的作用也就比严格好氧菌或严格厌氧菌的作用更为重要。而从环境样品中全面有效的筛选出兼性厌氧菌(群)是了解兼性厌氧菌在环境中作用及应用的基础和前提，所以全面有效的筛选出兼性厌氧菌(群)对于了解兼性厌氧菌在环境中作用及应用有着重要的意义。
发明内容
本发明利用间歇梯度曝氧技术，提供了一种筛选率和准确率都很高的兼性厌氧菌筛选的新方法和装置，该方法和装置可以实现有效的兼性厌氧菌的分离，同时也克服了现有兼性厌氧菌分离方法和装置中存在的不足。在第一方面，本发明提供了一种对样品中兼性厌氧菌进行筛选的方法，所述方法包括以下步骤(1)在无氧条件下对所述样品无氧培养第一无氧时间；(2)然后在有氧条件下对所述样品有氧培养第一有氧时间；(3)将以上步骤(1)和( 再重复至少1个周期，其中在每次重复中无氧培养时间与前次无氧培养的时间相同或不同，并且有氧培养时间长于前次有氧培养时间。在一个实施方案中，本发明第一方面的方法中的无氧培养时间可以是约8-72小时，优选约12-14小时，例如是约M小时。
在另一个实施方案中，本发明第一方面的方法中的有氧培养第一有氧时间是约 0. 5-24小时，优选约是0. 5-12小时，例如是约0. 5小时。后续有氧培养时间长于前次有氧培养时间。例如，在一个实施方案中，后续有氧培养中的有氧培养时间均是前次有氧培养时间约2倍。在又一实施方案中，后续有氧培养中的有氧培养时间均是前次有氧培养时间约2 倍。在另一个实施方案中，本发明第一方面的方法中步骤(3)的重复至少是例如2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30 或更多个周期。在一个具体的实施方案中，本发明第一方面的方法中的步骤(3)中的重复是8个周期，无氧培养时间都是约M小时，有氧培养第一有氧时间和后续有氧培养时间分别是 0. 5、1、2、4、8、12、24、48 和 72 小时。在另一个具体的实施方案中，本发明第一方面的方法中的步骤(3)中的重复是5 个周期，无氧培养时间都是约M小时，有氧培养第一有氧时间和后续有氧培养时间分别是 4、8、12、24、48 和 72 小时。在另一个具体的实施方案中，本发明第一方面的方法中的步骤(3)中的重复是4 个周期，无氧培养时间都是约M小时，有氧培养第一有氧时间和后续有氧培养时间分别是 8、12、24、48 和 72 小时。在第二方面中，本发明提供了一种对样品中兼性厌氧菌进行筛选的方法，所述方法除了包括本发明第一方面中步骤之外，还包括以下步骤(4)对步骤(1)-03)得到环境样品培养物进行分离，得到兼性厌氧菌群的单菌株。在一个实施方案中，本发明第二方面步骤中的分离可以通过涂布、划线分离等方法进行。本发明的利用间歇梯度曝氧技术改良的兼性厌氧菌筛选新方法克服了传统方法筛选出的兼性厌氧菌群中混杂了严格好氧菌和严格厌氧菌和兼性厌氧菌种类较少等不足， 与现有兼性厌氧菌筛选方法相比较，具有以下优点(1)本方法使用的仪器耗材相对比较简单，操作简单方便；(2)本方法是通过梯度间歇曝氧技术逐渐增加好氧培养时间的在同一装置中厌氧培养和好氧培养间隔的富集培养得到兼性厌氧菌群，所得到的菌群完全是兼性厌氧菌，没有严格厌氧菌或严格好氧菌混杂；(3)本方法是通过梯度间歇曝氧技术逐渐增加好氧培养时间，兼性厌氧菌对曝氧的时间有一个适应过程，不会因为突然长时间曝氧，而造成某些兼性厌氧菌不生长，也就能更全面和有效的筛选出样品中的兼性厌氧菌，筛选出的兼性厌氧菌的种类较多。在第三方面中，本发明提供了实施本发明的兼性厌氧菌筛选方法的装置，所述装置包括(1)用于装入培养基并培养待测样品的容器；(2)用于封住所述容器的不透气密封物；(3)与所述容器通过密封管线连接的抽真空装置；(4)将惰性气体充入所述器中的充气装置；以及(5)用于封住所述容器的透气封口膜。
在一个具体的实施方案中，本发明的兼性厌氧菌筛选装置包括(1)用于装入培养基并培养待测样品的三角瓶；(2)用于封住所述三角瓶的不透气橡胶塞；(3)所述容器通过密封管线连接的真空泵；(4)将惰性气体充入所述器中的注射器；以及(5)用于封住所述容器的透气封口膜，例如其通气孔径为0. 22 μ m0
下面将结合附图对本发明的具体实施方案结果进行详细描述图1筛选初始和结束时太湖湖滨湿地沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数。图1显示的结果是采用利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从太湖湖滨湿地沉积物中筛选兼性厌氧菌过程中初始和结束时沉积物中的严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数。由图中可以看出经过间歇梯度曝氧法筛选后，沉积物中的严格好氧菌和严格厌氧菌的菌群数几乎为零，而兼性厌氧菌的菌群数相对于初始沉积物中的兼性厌氧菌的菌群数并没有太大的变化，说明利用间歇梯度曝氧法从以兼性厌氧菌为优势菌群的环境样品中筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧菌或严格厌氧菌混杂， 而且筛选过程中兼性厌氧菌群对曝氧时间能很好的适应，没有产生因长时间曝氧而引起的某些兼性厌氧菌不生长的情况，即梯度间歇曝氧法能全面有效的筛选出湖滨湿地沉积物中的兼性厌氧菌群。图2筛选初始和结束时河流沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数.图2显示的结果是采用利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从河流沉积物中筛选兼性厌氧菌过程中初始和结束时沉积物中的严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数。由图可以看出经过间歇梯度曝氧法筛选后沉积物中的严格好氧菌和严格厌氧菌的菌群数几乎为零，而兼性厌氧菌的菌群数相对于初始沉积物中的兼性厌氧菌的菌群数略有上升，说明利用间歇梯度曝氧法从严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数基本相同的环境样品中筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧菌或严格厌氧菌混杂， 而且筛选过程中兼性厌氧菌群对曝氧时间能很好的适应，没有产生因长时间曝氧而引起的某些兼性厌氧菌不生长的情况，即间歇梯度曝氧法能全面有效的筛选出河流沉积物中的兼性厌氧菌群。图3筛选初始和结束时太湖湖滨湿地沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数.图3显示的结果是采用4小时为第一有氧培养时间的利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从沉积物中筛选兼性厌氧菌过程中初始和结束时沉积物中的严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数。由图可以看出经过间歇梯度曝氧法筛选后沉积物中的严格好氧菌和严格厌氧菌的菌群数几乎为零，而兼性厌氧菌的菌群数相对于初始沉积物中的兼性厌氧菌的菌群数增大了，说明利用间歇梯度曝氧法从严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数基本相同的环境样品中筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧菌或严格厌氧菌混杂，而且筛选过程中兼性厌氧菌群对曝氧时间能很好的适应，没有产生因长时间曝氧而引起的某些兼性厌氧菌不生长的情况，即间歇梯度曝氧法能全面有效的筛选出河流沉积物中的兼性厌氧菌群。
图4筛选初始和结束时太湖湖滨湿地沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数.图4显示的结果是采用8小时为第一有氧培养时间的利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从沉积物中筛选兼性厌氧菌过程中初始和结束时沉积物中的严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数。由图可以看出经过间歇梯度曝氧法筛选后沉积物中的严格好氧菌和严格厌氧菌的菌群数几乎为零，而兼性厌氧菌的菌群数相对于初始沉积物中的兼性厌氧菌的菌群数增大了，说明利用间歇梯度曝氧法从严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数基本相同的环境样品中筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧菌或严格厌氧菌混杂，而且筛选过程中兼性厌氧菌群对曝氧时间能很好的适应，没有产生因长时间曝氧而引起的某些兼性厌氧菌不生长的情况，即间歇梯度曝氧法能全面有效的筛选出河流沉积物中的兼性厌氧菌群。
具体实施例方式提出以下具体实施方式
，以便使本领域普通技术人员更好地理解本发明，所述具体实施方式
仅出于示例性目的，并非意在限制本公开的范围。在第一方面，本发明提供了一种对样品中兼性厌氧菌进行筛选的方法，所述方法包括以下步骤(1)在无氧条件下对所述样品无氧培养第一无氧时间；(2)然后在有氧条件下对所述样品有氧培养第一有氧时间；(3)将以上步骤(1)和( 再重复至少1个周期，其中在每次重复中无氧培养时间与前次无氧培养的时间相同或不同，并且有氧培养时间长于前次有氧培养时间。在第二方面中，本发明提供了一种对样品中兼性厌氧菌进行筛选的方法，所述方法除了包括本发明第一方面中步骤之外，还包括以下步骤(4)对步骤(1)-03)得到环境样品培养物进行分离，得到兼性厌氧菌群的单菌株。在本发明的方法中，无氧培养时间可以是约8-72小时，时间越长，筛选出来的菌群中混杂的严格好氧菌越少，但时间过长则会使操作复杂，增加不必要的培养时间，还有可能在长期的培养中因营养等条件的影响而使某些菌死亡等。无氧培养时间优选可以是约 12-48小时，例如是约24小时。在本发明的方法中，有氧培养第一有氧时间可以是约0. 5-24小时，时间越长，整个操作更简单，筛选时间周期更短，但时间过长则有可能会使某些兼性厌氧菌因无法适应突然长时间曝氧而死亡。有氧培养时间优选可以是约0. 5-12小时，例如是约0. 5小时。在本发明的方法中，步骤(3)的重复至少1周期就可以实现本发明的目的，但重复周期次数越多筛选出的兼性厌氧菌群中所混杂的严格厌氧菌和严格好氧菌越少，但过多次重复周期会增加操作复杂度、成本、筛选培养时间，还有可能在长期的培养中因营养等条件的影响而使某些菌死亡等。所以，一般优选重复1-30个周期，更优选5-20个周期，例如8 个周期。在本发明的方法中，每次重复中的有氧培养时间长于前次有氧培养时间，例如有氧培养时间均是前次有氧培养时间约2倍。最后一次有氧培养的时间优选是72小时，因为能在好氧72小时条件下生长的细菌在更长的好氧时间的条件下也能生长。
第一次有氧培养和最后一次有氧培养之间的有氧培养的时间介于前两者的时间之间，可以在其之间均勻分布或不均勻分布，例如可以是均勻分布或指数分布。在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中，步骤(3)中的重复是8个周期，无氧培养时间都是约M小时，有氧培养第一有氧时间和后续有氧培养时间分别是约0. 5、1、 2、4、8、12、24、48 和 72 小时。在本发明第二方面的方法步骤中的分离可以通过本领域技术人员已知的单菌落分离的方法进行，例如通过涂布、划线分离等方法进行。在本发明的方法中，本领域中通常使用的细菌培养基可用于实施本发明，本领域技术人员可以根据需要选择适合的培养基，例如筛选能降解煤油的兼性厌氧菌时可以使用煤油培养基以煤油为碳源和氮源，无机盐溶液(例如NH4NO3, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4 · 7H20， MgCl2 · 6H20, NaCl，FeSO4 · 7H20, CaCl2, ZnCl2)。例如，本发明方法中使用的培养基除了可以能提供一般细菌生长所需的碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)等之外，还优选提供兼性厌氧菌厌氧呼吸过程中所需的电子受体，如常见的NO” S042_、Fe(III)、Mn(IV) 等。培养基中优选不含使好氧细菌或厌氧细菌快速大量生长的营养成份。例如，本发明的方法中使用的培养基可以取自天然环境，例如湖底沉积物或河底沉积物；在一些实施方案中， 还任选根据需要加入其他组分，例如加入多种盐(例如Na2C03、CaCl2 · 6H20、MnSO4 · 7H20、 FeSO4, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4 · 7H20 等)。在本发明的方法中，培养的温度可以为一般细菌生长的最佳温度，例如 250C -30°C，为保证在筛选过程中，培养容器中的环境均一，优选培养过程中应保持其处于摇晃状态，例如在转速100-200rpm下摇晃。在一个具体的实施方案中，本发明的兼性厌氧菌筛选方法包括如下步骤(1)将所要用的培养基分装至一个容器，并灭菌，在无菌操作环境中，按一定比例将待测样品加入所述容器中，并用灭菌的不透气密封物封住所述容器；(2)用真空泵将所述容器中的空气抽出后，再将惰性气体例如N2充入所述器中。为了达到充分的厌氧环境，可以如此将容器中的空气用所述惰性气体置换三次，将置换好的容器厌氧培养M小时；(3)厌氧培养M小时后，在无菌操作环境中，将所述容器密封物换成无菌的透气封口膜。好氧培养0.5小时。封口膜用之前在121°C、0. IlMPa的条件下灭菌30分钟。(4)再重复步骤( 厌氧培养M小时后，重复步骤C3)好氧培养1小时，如此重复步骤( 和步骤C3)至好氧培养72小时，整个过程中厌氧培养时间都为M小时，而好氧培养时间分别为0. 5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，72小时；(5)任选地，将通过以上步骤可得到环境样品中兼性厌氧菌群，通过例如涂布、划线分离等方法可以得到其中单株的兼性厌氧菌。在一个具体的实施方案中，本发明的兼性厌氧菌筛选方法，包括如下步骤(1)将所要用的培养基分装至磨口三角瓶，在121°C、0. IlMPa的条件下灭菌30分钟。待培养基的温度降至室温后，在无菌操作环境中，按一定比例将环境样品加入三角瓶中，并用经75%酒精擦拭、紫外灭菌螺纹不透气橡胶塞封住三角瓶；(2)用装有注射器针头的真空泵将三角瓶中的空气抽出至橡胶塞向里凹陷，再从充满队的气体袋中，用带注射器针头的注射器将队充入三角瓶中，如此将三角瓶中的空气用N2置换三次以达到厌氧环境，将置换好的三角瓶放在30°C、200rpm的摇床中培养M小时；(3)厌氧培养M小时后，在无菌操作环境中，将螺纹橡胶塞换成带有孔径为 0. 22 μ m滤膜的透气封口膜，放在30°C、200rpm的摇床中好氧培养0. 5小时，封口膜用之前在121°C、0. IlMPa的条件下灭菌30分钟；(4)再重复步骤( 厌氧培养M小时后，重复步骤C3)好氧培养1小时，如此重复步骤( 和步骤C3)至好氧培养72小时，整个过程中厌氧培养时间都为M小时，而好氧培养时间分别为0. 5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，72小时；(5)任选地，通过以上步骤可得到环境样品中兼性厌氧菌群，通过例如涂布、划线分离等方法可以得到其中单株的兼性厌氧菌。在上述实施方案中，所述利用间歇梯度曝氧技术改良的兼性厌氧菌筛选装置中的螺纹不透气橡胶塞不能高温高压灭菌，可以采用其他灭菌方式，例如先用75%的酒精消毒， 再用紫外灭菌30分钟。而其他所有需要灭菌的器具可以进行高温高压灭菌，例如在121°C、 0. IlMPa的条件下灭菌30分钟。在一个实施方案中，本发明的兼性厌氧菌筛选方法中的厌氧环境可通过例如抽真空并充如氮气的方法达到的，例如用螺纹不透气橡胶塞封住磨口三角瓶，并用装有注射器针头的真空泵将三角瓶中的空气抽出至橡胶塞向里凹陷，再从充满队的气体袋中，用带注射器针头的注射器将N2充入三角瓶中。如此将三角瓶中的空气用N2置换多次例如3次以达到厌氧环境。在一个实施方案中，本发明的兼性厌氧菌筛选方法中好氧环境是通过如下方法达到的在无菌操作环境中，将不透气橡胶塞换成孔径为0. 22μπι滤膜的透气封口膜以达到好氧环境。在本发明的兼性厌氧菌筛选方法中，所述细菌培养优选在摇床中进行，以保证培养过程中装置中的环境是均勻的，例如在200rpm下摇晃培养。在一个具体的实施方案中，本发明的兼性厌氧菌筛选装置包括(1)用于装入培养基并培养待测样品的容器；(2)用于封住所述容器的不透气密封物；(3)与所述容器通过密封管线连接的抽真空装置；(4)将惰性气体充入所述器中的充气装置；以及(5)用于封住所述容器的透气封口膜。在上述装置中，所述容器可以是任何可用于培养无生物的容器，例如由玻璃制成， 或者由塑料制成，例如试管、培养皿、烧瓶等。用于封住所述容器的不透气密封物可以是塞子例如橡胶塞子。所述抽真空装置可以是本领域中已知的任何抽真空装置，例如真空泵。所述充气装置可以是本领域已知的任何充气装置，例如注射器。用于封住所述容器的透气封口膜的透气孔必须小于空气中常见细菌的大小，例如通气孔径为0. 22 μ m，这种透气(孔径为0. 22 μ m)封口膜可以通过购买获得，例如可从上海普林斯顿生物科技发展有限公司购买。在一个更具体的实施方案中，一种兼性厌氧菌筛选装置包括(1)用于装入培养基并培养待测样品的三角瓶；
(2)用于封住所述三角瓶的不透气橡胶塞；(3)所述容器通过密封管线连接的真空泵；(4)将惰性气体充入所述器中的注射器；以及(5)用于封住所述容器的透气封口膜，例如其通气孔径为0. 22 μ m0实施例1 下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在本实施例中，利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从太湖湖滨湿地沉积物(于2010年04月10日采集自太湖湖滨湿地(经度E 120° 03' 282 ；纬度 N 31° 24' 361)，在沉积物中加入体积比为50%左右的同一地点的沉积物上覆水以模拟当地环境，在10天内使用)中筛选出兼性厌氧菌群，包括如下步骤(1)按如下成份用双蒸水配置无机盐培养基(g/L) =Na2CO3 0. 1，CaCl2 ·6Η20 0. 01， MnSO4 · 7Η20 0. 02，FeSO4 0· 01，Na2HPO4 0. 05，KH2PO4 0. 03，MgSO4 · 7Η20 0. 02。以上所有无机盐均购自国药集团化学试剂北京有限公司。(2)将IOOml无机盐培养基分装至24#的250ml磨口三角瓶，在121°C、0. IlMPa的条件下灭菌30分钟。待培养基的温度降至室温后，在无菌操作环境中，加入IOOg太湖湖滨湿地沉积物至三角瓶中，并用经75%酒精擦拭、紫外灭菌30分钟的24#螺纹不透气橡胶塞封住三角瓶。在200rpm的摇床中混勻30分钟。取Iml样测定沉积物中好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌的菌群数(如下文所述)。(3)用装有Iml注射器针头的真空泵(津腾GM_0. 33A)将三角瓶中的空气抽出至橡胶塞向里凹陷，再从充满队的气体袋中，用带Iml注射器针头的50ml —次性注射器(购自上海治宇医疗器械有限公司)将N2充入三角瓶中。如此将三角瓶中的空气用N2置换三次以达到厌氧环境。将置换好的三角瓶放在30°C、200rpm的摇床中培养M小时。(4)厌氧培养M小时后，在无菌操作环境中，将螺纹橡胶塞换成带有直径为24mm、 孔径为0. 22 μ m滤膜的透气封口膜(上海普林斯顿生物科技发展有限公司)。放在30°C、200rpm的摇床中好氧培养0. 5小时。封口膜在用之前放在121 °C、 0. IlMPa的条件下灭菌30分钟。(5)再重复步骤C3)厌氧培养M小时后，重复步骤(4)好氧培养1小时，如此重复步骤C3)和步骤(4)至好氧培养72小时。整个过程中厌氧培养时间都为M小时，而好氧培养时间分别为0. 5小时，1小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，72小时。好氧培养72小时后，取Iml样测定其好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌的菌群数(如下文所述)O(6)好氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌和菌群数通过以下方法进行测定用MPN法测定了沉积物中好氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数。所用培养基为含0.2g/L MgSO4 ·7Η20 的营养琼脂(购自北京市双旋微生物培养基制备厂)。培养基倒成平板后，每个平板用四条平行线和三条垂直线分成20个区域。Iml沉积物(测定其质量和含水率)加至9ml已灭菌的生理盐水(0. 9% NaCl)中，作为ΙΟ—1稀释度，并依次稀释10倍至10_8。每个稀释度取20 μ 1至平板上的一个小区域，做5个平行样。好氧菌放在生化培养箱(太仓LRH生化培养箱)中培养，厌氧菌放在厌氧箱(Hirayama制造公司生产的FA-12厌氧箱)中培养，兼性厌氧菌先放在厌氧箱里培养M小时，再在生化培养箱中培养72小时后厌氧培养至同厌氧菌一起计数，培养温度为30°C。好氧菌培养时间为一个星期，厌氧菌、兼性厌氧菌培养时间为一个月，记录下每个稀释度的生长情况，并根据US EPA发明的MPN法进行计算得出细菌数。以下结合图1对筛选结果进行分析说明从图1中可以看出，初始的沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数(Log(MPN)/g)分别为4. 1,3. 5和5. 5，而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，沉积物中严格厌氧菌和严格好氧菌的菌群数几乎为零，即所得到的兼性厌氧菌群中没有严格厌氧菌和严格好氧菌混杂。而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，兼性厌氧菌的菌群数(Log(MPN)/g) 为5. 7，说明利用间歇梯度曝氧法能全面有效的筛选出沉积物中的兼性厌氧菌群，避免了传统方法因突然长时间曝氧而造成的某些兼性厌氧菌的不生长。从本实施例可知，本发明所用的利用间歇梯度曝氧法改良的兼性厌氧菌筛选新方法能全面有效的筛选出以兼性厌氧菌为优势菌群的环境样品中的兼性厌氧菌群，筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧或严格厌氧菌混杂。实施例2:在本实施例中，利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从河流沉积物(2010年05月12日采自北京小清河，样品的保存和使用时间与实施例1相同)中筛选出兼性厌氧菌群，步骤同实施例1。以下结合图2对筛选结果进行分析说明从图2中可以看出，初始的沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数(Log (MPN)/g)分别为3. 9,4. 1和4. 3，而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，沉积物中严格厌氧菌和严格好氧菌的菌群数几乎为零，即所得到的兼性厌氧菌群中没有严格厌氧菌和严格好氧菌混杂。而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，兼性厌氧菌的菌群数(Log(MPN)/g) 为4. 7，说明利用间歇梯度曝氧法能全面有效的筛选出沉积物中的兼性厌氧菌群，避免了传统方法因突然长时间曝氧而造成的某些兼性厌氧菌的不生长。从本实施例可知，本发明所用的利用间歇梯度曝氧法改良的兼性厌氧菌筛选新方法能全面有效的筛选出兼性厌氧菌群不为优势菌群的环境样品中的兼性厌氧菌，筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧或严格厌氧菌混杂。实施案例3:在本实施例中，利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从太湖湖滨湿地沉积物(同实施例1)中筛选出兼性厌氧菌群，包括如下步骤步骤(1)至步骤(3)与实施例1相同。步骤(4)也基本相同，不同的是第一有氧培养时间不同，在本实施案例中第一有氧培养时间为4小时。步骤(5)与实施例1中的步骤(5)基本相同，不同的是有氧培养的时间不同，在本实施例中有氧培养的时间分别为4小时、8小时、12小时、24小时、48小时和72小时。步骤(6)与实施例1中的步骤(6)相同。以下结合图3对筛选结果进行分析说明
从图3中可以看出，初始的沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数(Log(MPN)/g)分别为4. 1,4. 2和4. 3，而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，沉积物中严格厌氧菌和严格好氧菌的菌群数几乎为零，即所得到的兼性厌氧菌群中没有严格厌氧菌和严格好氧菌混杂。而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，兼性厌氧菌的菌群数(Log(MPN)/g) 为5. 7，说明利用间歇梯度曝氧法能全面有效的筛选出沉积物中的兼性厌氧菌群，避免了传统方法因突然长时间曝氧而造成的某些兼性厌氧菌的不生长。从本实施例可知，本发明所用的利用间歇梯度曝氧法改良的兼性厌氧菌筛选新方法能全面有效的筛选出兼性厌氧菌群不为优势菌群的环境样品中的兼性厌氧菌，筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧或严格厌氧菌混杂。实施案例4:在本实施例中，利用间歇梯度曝氧新技术改良的兼性厌氧菌筛选方法，从太湖湖滨湿地沉积物(同实施例1)中筛选出兼性厌氧菌群，包括如下步骤步骤(1)至步骤(3)与实施例1相同。步骤(4)也基本相同，不同的是第一有氧培养时间不同，在本实施案例中第一有氧培养时间为8小时。步骤(5)与实施例1中的步骤(5)基本相同，不同的是有氧培养的时间不同，在本实施例中有氧培养的时间分别为8小时、12小时、24小时、48小时和72小时。步骤(6)与实施例1中的步骤(6)相同。以下结合图4对筛选结果进行分析说明从图4中可以看出，初始的沉积物中严格好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌的菌群数(Log(MPN)/g)分别为3. 8,3. 9和4，而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，沉积物中严格厌氧菌和严格好氧菌的菌群数几乎为零，即所得到的兼性厌氧菌群中没有严格厌氧菌和严格好氧菌混杂。而利用间歇梯度曝氧法进行筛选后，兼性厌氧菌的菌群数(Log(MPN)/g) 为6. 2，说明利用间歇梯度曝氧法能全面有效的筛选出沉积物中的兼性厌氧菌群，避免了传统方法因突然长时间曝氧而造成的某些兼性厌氧菌的不生长。从本实施例可知，本发明所用的利用间歇梯度曝氧法改良的兼性厌氧菌筛选新方法能全面有效的筛选出兼性厌氧菌群不为优势菌群的环境样品中的兼性厌氧菌，筛选出的兼性厌氧菌群中没有严格好氧或严格厌氧菌混杂。
权利要求
1.一种对样品中兼性厌氧菌进行筛选的方法，所述方法包括步骤(1)在无氧条件下对所述样品无氧培养第一无氧时间；(2)然后在有氧条件下对所述样品有氧培养第一有氧时间；(3)将以上步骤(1)和( 再重复至少1个周期，其中在每次重复中无氧培养时间与前次无氧培养的时间相同或不同并且有氧培养时间长于前次有氧培养时间。
2.权利要求1的方法，还包括步骤(4)对步骤(1)-03)得到环境样品的培养物进行分离，得到的单菌株。
3.权利要求1或2的方法，其中所述无氧培养时间是8-72小时。
4.权利要求4的方法，其中所述无氧培养时间是12- 小时。
5.权利要求1或2的方法，其中所述后续有氧培养中的有氧培养时间均是前次有氧培养时间2倍。
6.权利要求1或2的方法，其中所述有氧培养第一有氧时间是0.5小时小时，优选是0. 5小时-12小时，例如是0. 5小时。
7.权利要求1或2的方法，其中所述步骤(3)的重复是2-30个周期。
8.权利要求1或2的方法，步骤C3)中的重复是8、5或4个周期，其中所述无氧培养时间都是M小时，有氧培养第一有氧时间和后续有氧培养时间分别是0. 5、1、2、4、8、12、24、 48和72小时；分别是4、8、12、24、48和72小时；或者分别是8、12、24、48和72小时。
9.一种兼性厌氧菌的筛选装置，所述装置包括(1)用于装入培养基并培养待测样品的容器；(2)用于封住所述容器的不透气密封物；(3)与所述容器通过密封管线连接的抽真空装置；(4)将惰性气体充入所述器中的充气装置；以及(5)用于封住所述容器的透气封口膜。
10.一种兼性厌氧菌的筛选装置，所述装置包括(1)用于装入培养基并培养待测样品的三角瓶；(2)用于封住所述三角瓶的不透气橡胶塞；(3)所述容器通过密封管线连接的真空泵；(4)将惰性气体充入所述器中的注射器；以及(5)用于封住所述容器的透气封口膜。
全文摘要
本发明涉及一种对环境样品中兼性厌氧菌进行筛选的方法，以及实施所述方法的装置。该方法和装置可以实现有效的兼性厌氧菌的分离，同时也克服了现有兼性厌氧菌分离方法和装置中存在的不足。
文档编号C12M1/24GK102242074SQ20111009058
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者叶春, 朱琼芳, 李春华 申请人:叶春