专利名称：：C型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的用途的制作方法c型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的用途本发明涉及C型产气荚膜梭菌(C7os"^f/咖/7er/V/z^e/7S)用于制备疫苗的用途。梭菌是形成孢子的革兰氏阳性厌氧菌。梭菌被广泛公认为是家畜与野生动物的病原体。Songer，J.G.inTheClostridia;Chapter10:ClostridialDiseasesofAnimals,MolecularbiologyandPathogenesis,ed.Rood,J.I.etal.，AcademicPressLtd(1997)ISBN0-12-595020-9综述了各种梭菌和它们引起的动物疾病。在目前已知的梭菌种类中，产气荚膜梭菌有时被认为是最广泛存在的细菌病原体，而且在所有的梭菌种类中，它亳无疑问地是家畜中梭菌肠病最重要的原因。基于它们产生的主要毒素，产气荚膜梭菌种被再划分为五种型，A-E型。A和C型产气荚膜梭菌，与难辨梭菌是猪的主要肠道梭菌病原体。Songer，J,G.和Uzal，F.A,(J.Vet.Diagn.Invest17:528-536(2005))具体描述了猪中的梭菌肠感染。C型产气荚膜梭菌感染猪、牛、鸡、人、绵羊、狗和马。仔猪最容易受C型产气荚膜梭菌感染。在l-2天大的仔猪中，这种感染导致了30%-50%的发病率，和引起50%-100%的死亡率。较大的仔猪(1-2周龄)可能具有较长的感染过程。母猪是感染的普遍来源。保护仔猪的常用方法是用C型产气荚膜梭菌疫苗接种母猪，以诱导能通过初乳传递给它们的后代的抗体。这导致在仔猪最易受梭菌感染的时候，对仔猪高水平的保护。这种疫苗是基于类毒素。通常，它们是脱毒上清液疫苗，其中不存在细胞。Springer,S.和Selbitz，H.-J.(濯SImmum.andMedicalMicrobiol.24:333-336(1999))已经描述了类毒素疫苗。A型产气荚膜梭菌感染羔羊、山羊、小牛、鸡、猪、马、狗和人。在充分发育的猪中，A型产气荚膜梭菌是正常的肠菌群的成员。因此目前假设，充分发育的猪不受肠内A型产气荚膜梭菌存在的不利影响。但是它可能在新生的和断奶的猪中引起猪坏死性小肠结肠炎。用于保护猪对抗A型产气荚膜梭菌的疫苗很少。目前仅仅有一种商业可获得的(有条件地批准的)疫苗。这种情况的原因之一可能是，如上所述，A型产气荚膜梭菌是正常菌群的成员的事实。因此，人们不会期望它触发免疫系统。因此，人们不会期望诱导对抗A型产气荚膜梭菌的抗体产生。如果诱导了抗体，A型产气荚膜梭菌将不会存活于肠中，更别说是正常菌群的成员了。因此，更进一步地，人们当然不会期望母猪通过初乳传递任何保护给它们的后代了。无论由于什么原因，A型产气荚膜梭菌似乎不能诱导足够的免疫刺激。目前已经令人惊讶地发现，包含脱毒的培养物上清液的C型产气荚膜梭菌疫苗非常能诱导对抗A型产气荚膜梭菌感染的交叉保护。更令人惊讶的是，发现用C型产气荚膜梭菌培养物上清液接种母猪导致对它们的仔猪对抗A型产气荚膜梭菌感染的显著保护。更加令人惊讶的是，发现甚至母猪在这种疫苗接种以后也表现较好。这是令人惊讶的，因为如上所述，一般假设，充分发育的猪如母猪不受A型产气芙膜梭菌感染的不利影响。此发现第一次证明了相反的情况。因此，本发明的第一个实施方案涉及C型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的应用，该疫苗用于保护充分发育的猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。本发明的第二个实施方案涉及C型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的应用，该疫苗用于保护母猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。本发明的第三个实施方案涉及C型产气荚膜梭菌用于制备用于母猪的疫苗的应用，该疫苗用于保护仔猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。本发明的第四个实施方案涉及c型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的应用，该疫苗用于保护仔猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。因为本领域技术人员将理解，实际上，C型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的应用是一个两步的过程C型产气荚膜梭菌用于在培养基中生长，以获得培养物上清液，其是用于制备本发明的疫苗的基础。因此，本发明的另一个实施方案涉及C型产气荚膜梭菌培养物上清液用于制备疫苗的应用，该疫苗用于保护充分发育的猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。仍然是本发明的另一个实施方案，涉及C型产气荚膜梭菌培养物上清液用于制备疫苗的应用，该疫苗用于保护母猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。又是本发明的另一个实施方案，涉及C型产气荚膜梭菌培养物上清液用于制备用于母猪的疫苗的应用，该疫苗用于保护仔猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。还是本发明的一个实施方案，涉及C型产气荚膜梭菌培养物上清液用于制备疫苗的应用，该疫苗用于保护仔猪对抗A型产气荚膜梭菌感染。在C型产气荚膜梭菌毒素类型之间，可以在产生P刁毒素的那些菌林与不产生P-2毒素的那些菌林之间进行区分。所有的C型产气荚膜梭菌菌株中大约40%产生这种毒素。发现产生e_2毒素的C型产气荚膜梭菌比不产生P-2毒素的C型产气荚膜梭菌更适合。Fisher，D.J.等人(Inf.&Immun.74:5200-5210(2006))描述了这种菌抹和它们的鉴定。因此，该实施方案的一个优选形式涉及一种应用，其中使用产生0-2毒素的C型产气荚膜梭菌。如上所述制备的疫苗决不是在工业的猪饲养过程中施用给猪的唯一疫苗。经常在大约与对抗其他的猪病原生物和病毒的疫苗同时提供梭菌的疫苗。因此，在另一个优选的实施方案中，如本发明中所述制备的疫苗另外包括一种或多种来源于猪病原生物或病毒的抗原，抗那些抗原的抗体或编码这种抗原的遗传信息。这种生物体或病毒优选地选自伪狂犬病病毒，PRRS病毒，猪流感病毒，猪细小病毒，猪传染性胃肠炎病毒，轮状病毒，大肠杆菌，红斑丹毒丝菌，支气管炎博德特氏菌，鼠伤寒沙门氏杆菌，猪霍乱沙门氏菌，副猪嗜血杆菌，多杀性巴氏杆菌，猪链球菌，猪肺炎霉形体，猪痢疾短螺旋体和胸膜肺炎放线杆菌。因此，这个实施方案的一种更优选的形式涉及一种如本发明中所迷制备的疫苗，其另外包括一种或多种来源于猪病原生物或病毒的抗原，其中这些生物体或病毒选自伪狂犬病病毒，PRRS病毒，猪流感病毒，猪细小病毒，猪传染性胃肠炎病毒，轮状病毒，大肠杆菌，红斑丹毒丝菌，支气管炎博德特氏菌，鼠伤寒沙门氏杆菌，猪霍乱沙门氏菌，副猪嗜血杆菌，多杀性巴氏杆菌，猪链球菌，猪肺炎霉形体，猪痢疾短螺旋体和胸膜肺炎放线杆菌。紧接着产气荚膜梭菌感染以后，仔猪经常遭受大肠杆菌感染。大肠杆菌是仔猪中另一种严重的肠道疾病的原因。因此，经常用大肠杆菌疫苗接种仔猪或妊娠母猪。大肠杆菌疫苗通常用于本领域，而且它们是市场上可买到的。因此，一种包括C型产气荚膜梭菌培养物上清液与大肠杆菌疫苗组分的组合疫苗是非常合乎需要的，因为它能防止C型产气荚膜梭菌，A型产气荚膜梭菌和大肠杆菌感染。因此，这个实施方案的一种最优选的形式涉及一种如本发明中所述制备的疫苗，其另外包括来源于猪病原生物大肠杆菌的一种或多种抗原。在下面的实施例中以非限制性方式对本发明进行举例说明。实施例C型产气荚膜梭菌抗原的产生将一抹标准的C型产气荚膜梭菌菌林，菌林587(也称为CWC1/S，来自WeybridgeU.K.Collection)培养于发酵罐中直到静止生长期开始。离心培养物，丢弃包含细菌细胞的沉淀。添加甲醛到上清液中至O.5%v/v的终浓度，以灭活毒素，接着通过超滤和0.2jjm过滤来进行浓缩。疫苗制备通过混合C型产气荚膜梭菌抗原与基于生育酚的佐剂来配制疫苗。每个疫苗剂量(2ml)包括20p117倍浓缩的C型产气荚膜梭菌抗原类毒素培养物上清液浓缩物。该疫苗遵照关于C型疫苗的安全和效力的欧洲药典专题论文0363(产气荚膜梭菌疫苗用于兽医应用)。另外，在这个实验中，添加纯化的大肠杆菌抗原(F4ab，F4ac，F5和F6纤毛和不耐热的毒素)，以抑制可能的大肠杆菌感染。这些组分是本领域已知的，而且本领域技术人员将知道如何制备基于这些组分的疫苗。作为选择，但是本领域技术人员能使用市场上可买到的而且现成即可4吏用的大肠杆菌疫苗，如PorcilisPorcoliDF(可通过IntervetInt.B.V.，WimdeKorverstraat35，Boxmeer，TheNetherlands获得)。对照疫苗包括相同的组分，除C型产气荚膜梭菌抗原之外，其不存在于对照组中。母猪的保护一个荷兰猪生产农场，其中曾有一次临床的A型产气荚膜梭菌爆发，被选择用于随机化双盲实地药效研究。发现分离自该农场的A型产气荚膜梭菌产生ct-毒素与P2-毒素。怀孕期间，产仔之前大约6到2周，母猪用仅仅包含大肠杆菌抗原的疫苗(对照组)或用包含大肠杆菌抗原和C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗(测试组)IM接种。疫苗用不同的颜色标记(2x测试疫苗，lx对照疫苗)，以保证双盲，两组中母猪的分配为大约2:1(表l)。表l.组大小<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从第一次疫苗接种当天直到仔猪断奶时(产仔以后3-4周)，每3天观察母猪的总体健康，采食量和腹泻。为了便于统计学分析，使用了临床打分系统(表2)。在生活的第一周期间，每天观察生来就接种的母猪的仔猪，从一周直到断奶每三天一次，此后每周一次直到看护期结束。记录总体健康，釆食量，腹泻和死亡率(表2)。表2用于母猪和仔猪的打分系统<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果表3.母猪的临床观察<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3显示了相较于用不含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种，用包含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种的影响。如从表3清楚得出的，用包含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种导致母猪健康状况非常显著的改善。接种母猪的后代的保护同样，将用包含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种的母猪的同窝仔中的死亡率与用不含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种的母猪的同窝仔中的死亡率进行比较。如从表4清楚得出的，用包含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种的母猪的同窝仔中的死亡率显著低于对照组。此外，表5表明来自用包含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种的母猪的仔猪具有显著低于对照组的临床分数。表4.对照和测试同窝仔中的每周死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表5.仔猪的临床观察<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结论:数据表明,用包含C型产气荚膜梭菌抗原的疫苗接种母猪导致在面临A型产气荚膜梭菌爆发时，接种的母猪和它们的后代健康状况显著的改善。权利要求1)C型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的应用，该疫苗用于保护充分发育的猪抗A型产气荚膜梭菌感染。全文摘要本发明涉及C型产气荚膜梭菌用于制备疫苗的应用。文档编号A61K39/08GK101541343SQ200780042707公开日2009年9月23日申请日期2007年11月19日优先权日2006年11月20日发明者J·F·M·斯密特斯,K·利德黑德,M·H·维特维利特申请人:英特威国际有限公司