专利名称：一种hiv重组亚型dna疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法。
背景技术：
HIV/AIDS是目前全人类共同面对的最严重的公共卫生问题之一。目前全球现存的HIV病毒携带者约为3060万 3610万人；另据我国卫生部统计数据显示截止2007年底，中国现存艾滋病病毒感染者和病人约70万(55万 85万人)，其中艾滋病病人8. 5万 (8万 9万人)。在经过了近25年的研究之后，人类对艾滋病病毒的认识已经取得了长足的进步， 例如在致病机理方面，人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因结构和编码蛋白相继被阐明，病毒的受体和辅助受体相继被发现；在药物治疗方面，核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)相继研制成功，并应用于临床，取得了良好效果，等等。尽管如此，我们离真正克服艾滋病还有很长一段距离，而造成这一局面的重要原因之一就是HIV病毒的迅速变异。HIV病毒的迅速变异导致了多种不同亚型和重组流行株出现，并且这些亚型和重组株在全球呈现不均勻分布，这在客观上给HIV疫苗的研究带来了极大的困难。在研制出具有广泛交叉保护能力的“理想"HIV疫苗之前，根据特定地区的HIV-I优势流行亚型，有针对性的设计疫苗不失为一个合理的选择。此外，以往的HIV疫苗研究经验提示我们特异性免疫反应的广度对HIV疫苗的保护效果十分重要，而提高疫苗免疫反应广度的重要手段之一便是增加疫苗所包含的抗原种类。就HIV-I而言，理想的疫苗不仅要包括feg、P0l、Env 三个结构蛋白，还应包括Tat、Nef、Rev等调节蛋白。近年来，特别是在Merck疫苗三期临床试验失败后，由多个病毒抗原基因联合构成免疫原的疫苗设计策略在国际上逐渐兴起，国内这方面研究开展较少，尤其是针对HIV-I AE重组亚型病毒的疫苗研究尚处于空白阶段。在HIV-I疫苗研制上，针对HIV-I胞膜蛋白Env的疫苗已有较多研究，但是已有的针对HIV -1胞膜蛋白Env疫苗尚不能十分有效的诱导中和抗体。最近，许多研究转向了研制针对HIV-I病毒相对比较保守结构蛋白gag和调节蛋白tat的疫苗上，Gag蛋白表面富含CTL表位和T辅助细胞表位，以其为靶蛋白开发的DNA疫苗能诱发有效的中和抗体和CTL 反应，且可能对不同亚型病毒产生交叉保护，因而成为目前HIV疫苗研究的热点之一。HIV Tat蛋白亦是HIV较为保守的蛋白，在病毒感染早期表达，并对病毒生活周期是必需的，Tat 蛋白增加HIV病毒在体内传播的速度，对Tat蛋白高水平的体液和细胞免疫与良好的预后呈正相关，Tat疫苗所诱导的抗体能中和胞外Tat对机体各系统的损害，控制AIDS相关疾病的发生。最近Rezza等通过对252只感染HIV-I猴子的动物试验观察，发现高水平的 anti-Tat抗体伴随HIV长期非进展性感染(long-term nonprogression)，而anti-Tat抗体阴性的动物则很快进展为免疫缺陷。针对Nef、Rev、Pol等蛋白的单价疫苗亦有大量研究， 但效果均欠佳。于是有许多研究将重点放在了 HIV-I多基因融合DNA疫苗研制上，因为疫苗诱发的免疫反应的广度对HIV-I疫苗的保护效果有着深远的影响机体免疫系统所能识别的关键表位越多，病毒就越不容易逃逸。而现有的候选疫苗在抗原构成上多以HIV-I的结构蛋白为主，主要包含feg、Pol和Env;在调节蛋白中，通常仅包含Nef蛋白。从提高疫苗免疫反应广度的角度来看，这样的抗原构成是远远不够的，为了改善这一状况，很有必要构建HIV-I结构蛋白feig、Pol、Env与Tat、Nef、Rev调节蛋白基因的融合DNA疫苗并评价其免疫原性。我国是一个HIV-I多亚型平行流行的国家，流行病学调查显示，在我国HIV流行株中，AE重组亚型HIV-I是我国主要的HIV-I流行亚型之一，本研究拟以该亚型病毒研究对象，构建包括e/^、/7o入识仏iai、/^/和rer基因在内的DNA疫苗，并初步验证其免疫原性。
发明内容
本发明的目的是提供一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，通过以下步骤实现
(1)设计与合成密码子优化后的融合基因序列，
(2)DNA疫苗的构建和体外表达能力测定
A 重组质粒的酶切鉴定与测序将构建的重组质粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI进行双酶切，酶切产物进行W)琼脂糖凝胶电泳。其中，Gpl45TRN融合基因的片段长度为3423bp， 载体片段长度为5071 bp。电泳结果显示酶切结果与预期结果完全一致，结果见图1。DNA 双向序列测定结果显示插入序列与设计的序列完全一致；
B TRIVN融合蛋白真核表达用LipofectamineTM 2000将空载体质粒与重组质粒AE-Gpl45TRN分别转染四31~细胞，培养48 h后收集细胞，并制备蛋白样品进行 Western-Blot验证。在各泳道上样量基本相当的情况下，Western-Blot结果显示，重组质粒转染产物中出现约190KDa的特异性条带，与预期大小一致。本发明用LipofectamineTM 2000将空载体质粒与重组质粒AE_Gpl45TRN分别转染四31~细胞，培养48 h后收集细胞，并制备蛋白样品进行Western-Blot验证。在各泳道上样量基本相当的情况下，Western-Blot结果显示，重组质粒转染产物中出现约190KDa的特异性条带，与预期大小一致。本发明Gpl45-Tat-Rev_Nef编码基因的密码子优化和基因合成是通过Los Alamos HIV Database调取HIV_lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在线软件，按照哺乳动物的密码子偏好进行密码子优化，在抗原基因密码子优化合成过程中，按照文献报道对2个基因分别进行了定点突变Tat :C27S/K51T/R55L/G79A, Nef :K144R/D174K，合成基因简称为 AE-Gp145TRN。本发明按常规分子克隆方法将Ml I和EcoR V双酶切的tat-rev-integrase(c-h alf) -vif-nef基因连接入表达载体，通过限制性酶切和DNA测序的方法对所构建的质粒进行鉴定后，采用德国QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit试剂盒进行大量制备，制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中，pH7. 2，调整浓度为lmg/ml。本发明采用覆盖HIV-lAE2f亚型Env，Tat，Rev，htegrase，Vif和Nef全长蛋白的肽库来进行特异性T细胞反应检测。本发明以AE重组亚型HIV-I病毒为研究对象，构建包括env、pol、gag、tat、nef 和基因在内的DNA疫苗，与AE-TRIVN相比，AE_Gpl45TRN能够使特异性T细胞反应在Tat、Rev、Nef三个蛋白间更均勻的分布，提高了疫苗所活化的免疫反应广度。
图1是DNA疫苗AE-Gp 145TRN的酶切鉴定结果，1泳道为AE-Gp 145TRN的BamHI/ XbaI双酶切产物。图2重组质粒AE_Gpl45TRN的体外表达验证，1泳道为空载体对照，3泳道为 AE-Gpl45TRN的转染后产物，1泳道与3泳道的蛋白上样量基本一致。图3各组间总T细胞反应强度的比较。图4特异性T细胞反应在不同病毒蛋白间分布的比较。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1
菌株、细胞和质粒感受态大肠杆菌DH5 α和转染用细胞为本实验室保存。表达 HIV-lAE2f tat~rev~integrase (c-hafl)-vif-nef1 融合基因的 DNA 疫苗由复旦大学生物医学研究院提供。工具酶和主要试剂各种限制性内切酶、T4连接酶和其他工具酶均购自大连宝生物公司。真核细胞转染试剂盒Lipofectamine 2000购自美国hvitrogen公司。质粒大量提取盒 EndoFree Plasmid Giga Kit 购自德国 QIAGEN 公司。Mouse IFN-y ELISP0T 试剂盒购自美国BD公司。本研究中采用覆盖HIV_lAE2f亚型Env，Tat，Rev，htegrase (C-half 144 aas)，Vif和Nef全长蛋白的肽库来进行特异性T细胞反应检测。编码基因的密码子优化和基因合成通过Los Alamos HIV Database调取 HIV_lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在线软件(http://www. jcat. de/)，按照哺乳动物的密码子偏好进行密码子优化。为了消除野生型的tat、基因潜在安全隐患，在抗原基因密码子优化合成过程中，我们按照文献报道对上述2个基因分别进行了定点突变 Tat (C27S/K51T/R55L/G79A)，Nef (K144R/D174K)，合成基因简称为 AE_Gpl45TRN。疫苗构建、鉴定和大量制备按常规分子克隆方法将Ml I和EcoR V双酶切的t at-rev-integrase (c-half) -vif-nef基因连接入表达载体，通过限制性酶切和DNA测序的方法对所构建的质粒进行鉴定后，采用德国QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit试剂盒进行大量制备，具体操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中(ρΗ7· 2)，调整浓度为lmg/ml。体外转染与表达鉴定在6孔板中接种5X IO6个/ml 293T细胞2 ml，培养过夜， 至细胞铺满各孔的90%-95%，换用无血清无抗生素的DMEM，每孔2 ml。随后，按试剂盒说明进行转染操作。4 后收取细胞，制备蛋白样品进行10%的SDS-PAGE。电泳所得的凝胶进行湿转OOO mA电流，120 min)，转至PVDF膜上。放入5%脱脂奶里封闭1 h，按1 :100 加入稀释的HIV-I阳性血清，室温反应2 h，PBST洗涤3次，再加入1 :2000稀释的HRP标记的山羊抗人IgG抗体，室温反应1 h，PBST洗涤3次，加入DAB底物进行膜上显色。动物免疫将体重为18 22 g的SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为3组空载体对照组、AE-TRIVN免疫组和AE-Gpl45TRN免疫组。分别于0、2、4、7周在小鼠右侧胫前肌注射100 μ g DNA。于第9周分离脾细胞进行免疫检测。细胞免疫反应的检测ELISP0T平板每孔加入100 μ 1包被抗体，4°C包被过夜后用1640完全培养基洗涤3次，加入封闭液200 μ 1/孔，室温封闭2 h，弃去封闭液，将分离的小鼠脾细胞按2 X IO5每孔加入ELISP0T板，实验孔加入多肽(终浓度4 μ g/ml)，阳性孔加入PMA (终浓度20 ng/ml)和ionomycine (终浓度500 ng/ml)，空白对照只加入脾细胞， 补充1640完全培养基至100 μ 1,37°C,5%C02孵育20 h，弃去细胞悬液，每孔加入200 μ 1 去离子水洗2次后换用PBST溶液洗涤3次，甩去洗液，拍干，用含10%血清的PBS按1 :250 稀释检测抗体，每孔加入100 μ 1，室温孵育2 h。PBST洗涤3次后，用含10%血清的PBS按 1 100稀释HRP标记抗体，每孔加入100 μ 1于ELISP0T板中，室温孵育1 h。弃掉液体，拍干。每孔加入100 μ 1底物，闭光放置5-30 min后用去离子水终止显色。晾干，用北京赛智ChampSpot III酶联斑点分析仪计数分析。统计学方法数据均以均值士标准差表示，两组间均值的统计比较使用非配对t 检验，以p<0. 05作为差异有显著性的标准。实施例2
A 重组质粒的酶切鉴定与测序将构建的重组质粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI进行双酶切，酶切产物进行W)琼脂糖凝胶电泳。其中，Gpl45TRN融合基因的片段长度为3423bp， 载体片段长度为5071 bp。电泳结果显示酶切结果与预期结果完全一致，结果参见图1。 DNA双向序列测定结果显示插入序列与设计的序列完全一致；
B TRIVN融合蛋白真核表达用LipofectamineTM 2000将空载体质粒与重组质粒AE-Gpl45TRN分别转染四31~细胞，培养48 h后收集细胞，并制备蛋白样品进行 Wiestern-Blot验证。在各泳道上样量基本相当的情况下，Western-Blot结果显示，重组质粒转染产物中出现约190KDa的特异性条带，与预期大小一致(图2)，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。HIV-lae2f gpl45/tat/rev/nef 3417bp，序列中 1 2109 :gpl45，2122 2415 :tat 突变设计(C27S/K51T/R55L/G79A) ,2428^2793 :rev, 2806^2417 :nef 突变设计(K144R/ D174K)，粗体显示的是由四个甘氨酸组成的连接子，克隆位点5、端)(ba 端BamH I。免疫原性评价
在DNA疫苗的设计上，主要解决了以下两方面的问题 (1) DNA疫苗的安全性，包括Tat蛋白的突变失活、整合酶的去除野生型的HIV-I Tat蛋白有潜在毒性，它不仅能够激活处于静息状态的HIV-I前病毒，还能够对宿主细胞造成负面影响。为了消除野生型Tat的负面影响，我们将在序列设计过程中按照文献报道对Tat蛋白进行突变失活，共涉及四个氨基酸位点的突变，分别为 C27S，K51T，R55L和G79A。上述四个位点的联合突变既能够很好的消除Tat蛋白对病毒基因和细胞基因调节作用，同时又不会削弱Tat的免疫原性。此外，为了避免整合酶可能带来的潜在危险，我们亦将其从Pol蛋白去除。疫苗的免疫原性
构建env-tat-nef-rev融合基因DNA疫苗，提高疫苗免疫反应广度。a.免疫结束后3周无菌分离小鼠脾细胞，采用HIV-lAE2f肽库刺激后，用Elispot 方法进行特异性细胞免疫反应检测。显示的结果为扣掉本底(未加肽刺激孔的斑点数)后的每10万个脾淋巴细胞的Elispot斑点数；每只小鼠的总反应强度是将Tat，Rev和Nef共三个肽池的斑点数叠加后的结果。从总T细胞反应强度来看AE-TRIVN(148士91 SFCs/ΙΟ6脾细胞)显著高于Gpl45-TRN(55 ±28 SFCs/106脾细胞)，p=0. 017(图3)。将总T细胞反应按肽库分解后，我们发现AE-TRIVN所激发的特异性T细胞反应主要集中于Rev ；Gpl45_TRN 所激发的总T细胞反应强度虽然相对较弱，但却能使特异性T细胞反应在Tat、Rev和Nef 三个抗原间的更加均勻的分布(图4)。 b.技术方案分三步进行第一步，从Los Alamos HIV Database中调取HIV_1AE2F 的Env、Gag, Pol、Tat、Rev、Nef蛋白的氨基酸序列，经过必要的突变修饰之后，将其按人体细胞的密码子偏好逆向翻译成DNA序列，并送公司合成。第二步，利用合成基因构建DNA疫苗，体外验证基因表达情况。第三步，DNA疫苗接种Balb/C小鼠，检测小鼠体内的特异性免疫反应。
权利要求
1.一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现(1)设计与合成密码子优化后的融合基因序列，(2)DNA疫苗的构建和体外表达能力测定，A 重组质粒的酶切鉴定与测序将构建的重组质粒AE-Gpl45TRN用BamHI和)(baI进行双酶切，酶切产物进行W)琼脂糖凝胶电泳，其中，Gpl45TRN融合基因的片段长度为3423bp， 载体片段长度为5071 bp,电泳结果显示酶切结果与预期结果完全一致，DNA双向序列测定结果显示插入序列与设计的序列完全一致；B TRIVN融合蛋白真核表达用LipofectamineTM 2000将空载体质粒与重组质粒AE-Gpl45TRN分别转染四31~细胞，培养48 h后收集细胞，并制备蛋白样品进行 Western-Blot验证，在各泳道上样量基本相当的情况下，Western-Blot结果显示，重组质粒转染产物中出现约190KDa的特异性条带，与预期大小一致。
2.根据权利要求1所述的一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于， Gpl45-Tat-Rev_Nef编码基因的密码子优化和基因合成是通过Los Alamos HIV Database 调取HIV-lAE2f株的全基因信息，使用J Cat在线软件，按照哺乳动物的密码子偏好进行密码子优化，在抗原基因密码子优化合成过程中，按照文献报道对2个基因分别进行了定点突变:Tat :C27S/K51T/R55L/G79A, Nef :K144R/D174K，合成基因简称为 AE_Gpl45TRN。
3.根据权利要求1所述的一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，按常规分子克隆方法将Sal I和EcoR V双酶切的tat-rev-integrase (c-half)-vif-nef基因连接入表达载体，通过限制性酶切和DNA测序的方法对所构建的质粒进行鉴定后，采用德国 QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit试剂盒进行大量制备，制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中，pH7. 2，调整浓度为lmg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，采用覆盖HIV_lAE2f亚型Env，Tat, Rev, Integrase, Vif和Nef全长蛋白的肽库来进行特异性 T细胞反应检测。
全文摘要
本发明提供一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，通过以下步骤实现设计与合成密码子优化后的融合基因序列，DNA疫苗的构建和体外表达能力测定。本发明以AE重组亚型HIV-1病毒为研究对象，构建包括env、pol、gag、tat、nef和rev基因在内的DNA疫苗，与AE-TRIVN相比，AE-Gp145TRN能够使特异性T细胞反应在Tat、Rev、Nef三个蛋白间更均匀的分布，提高了疫苗所活化的免疫反应广度。
文档编号A61P31/18GK102210874SQ20111012761
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者卢微, 吕国才, 杨益大, 杨萍, 王晓燕, 谢珏, 郑临 申请人:浙江大学