专利名称：一种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种动物疫苗的制备方法，特别是一种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备 方法；本发明还涉及该疫苗的免疫使用方法。
背景技术：
鳗弧菌是危害水产养殖动物的重要病原菌，由其所引起的海水养殖鱼类发生的弧 菌病(Vibriosis)具有流行广泛、发病及死亡率高等特点，尤其是对半滑舌鳎养殖生产的 危害是相当严重的。因此，对鳗弧菌病的高效防治，以最大限度地降低其危害程度，将能显 著地提高半滑舌鳎养殖生产的经济效益。在海水养殖鱼类鳗弧菌病防控方面，目前在养殖 生产中大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制该病的发生与流行，但在长期的药物使 用中，我们发现药物治疗存在很多不足一是病因复杂，大量用药存在盲目性，很多疾病尚 无针对性的有效药物；二是一些化学药物有效面窄，预防作用弱，而且病鱼往往因厌食难以 摄取到有效的药物剂量；三是药物在动物体中残留，危害到人类的健康，且长期用药带来环 境污染，并导致耐药性微生物大量出现；此外，长期在药物“保护作用”下使大量本应被淘汰 的抗病力弱的个体存活下来且在种群中所占比例逐渐增大而导致整个群体的抗病能力下 降，严重影响了养殖业的发展。因此，应用免疫学技术预防鱼类细菌性疾病的发生已受到越 来越多的重视，已成为各国研究者关注的重要内容。现有技术中还没有适用于半滑舌鳎的 抗鳗弧菌病疫苗。因此，开发研制半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗，对于有效控制半滑舌鳎鳗弧菌病 的发生与流行具有重要的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高半滑舌鳎免疫 力、降低半滑舌鳎养殖过程中鳗弧菌病所造成的危害的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方 法。本发明所要解决的另一个技术问题是提供几种以上所述的半滑舌鳎鳗弧菌病疫 苗的使用方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一 种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方法，其特点是它以半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌 BHKListonella anguillarum BHl)为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其制备方法步骤如 下(1)将鳗利斯顿氏菌BHl菌株接种在普通营养肉汤培养基上，28-30°C培养24h，加 入体积终浓度为0. 3%的甲醛28-30°C灭活48h，得灭活菌体；(2)取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药lg/mL，得
黄芪浸出液；(3)将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制成半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗；二者的混合比 例为每毫升黄芪浸出液中加入的灭活菌体为8X101(lcellS。
以上所述的制备方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的使用方法可以采用浸泡免 疫的方法，先将受免半滑舌鳎在充气条件下用质量浓度为8%的NaCl溶液浸泡3-7min，然 后按体积比1 5用水稀释半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗得半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗溶液，再将受 免半滑舌鳎放于半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗溶液中充气浸泡lh，5-10天后按前述方法加强免 疫1次。以上所述的制备方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的使用方法可以采用注射免 疫的方法，取体长为15-20cm的半滑舌鳎按0. ImL/尾的免疫剂量进行初次注射免疫，后每 隔一周按前述免疫剂量加强免疫1次，共免疫4次。以上所述的制备方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的使用方法可以采用口服免 疫方法，将硬颗粒饲料用半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗浸泡后投喂，每天鱼体摄入灭活菌体量为 8X 106cells/g体重，连续投喂一周，隔周后再按前述方法进行加强免疫一周。本发明所述的半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌BHKListonella anguillarum BHl) (也即鳗弧菌菌株BHl)已经在公开文献《半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研 究》中所公开(菌株BHl)，上述公开文献发表于《海洋学报》，2009，31 (5) =I-Il0菌株BHl 的DNA序列长度及Genebank登录号见下表
16SrRNA 基因gyrB基因菌株编号序列长度 登录号序列长度 登录号BHl1444bp GQ2054441187bp GQ205449该菌株BHl为公知公用材料，现保存在淮海工学院海洋学院实验室，在本专利申 请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外发放。本发明制备方法以半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌BHl (Listonella anguiIlarumBHl)为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂。使用本发明方法制备的疫苗并进行半 滑舌鳎免疫，能显著提高半滑舌鳎抗鳗弧菌感染的能力，可有效预防半滑舌鳎养殖生产中 的鳗弧菌感染，减少半滑舌鳎死亡率，增加半滑舌鳎养殖的产量，保证半滑舌鳎养殖生产的 健康和可持续发展，提高半滑舌鳎养殖生产的经济效益。
具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解 本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1。一种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方法，它以半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏 菌BHKListonella angui llarum BHl)为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其制备方法步骤如 下(1)将鳗利斯顿氏菌BHl菌株接种在普通营养肉汤培养基上，30°C培养24h，加入 体积终浓度为0. 3%的甲醛30°C灭活48h，得灭活菌体；(2)取黄芪用蒸馏水浸泡60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药lg/mL，得黄芪 浸出液；(3)将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制成半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗；二者的混合比例为每毫升黄芪浸出液中加入的灭活菌体为8X101(lcellS。使用时采用浸泡免疫的方法，先将受免半滑舌鳎在充气条件下用质量浓度为8% 的NaCl溶液浸泡3-7min，然后按体积比1 5用水稀释半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗得半滑舌 鳎鳗弧菌病疫苗溶液，再将受免半滑舌鳎放于半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗溶液中充气浸泡lh， 5-10天后按前述方法加强免疫1次。实施例2。一种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方法，它以半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏 菌BHKListonella anguillarum BHl)为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其制备方法步骤如 下(1)将鳗利斯顿氏菌BHl菌株接种在普通营养肉汤培养基上，28°C培养24h，加入 体积终浓度为0. 3%的甲醛30°C灭活48h，得灭活菌体；(2)取黄芪用蒸馏水浸泡30min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药lg/mL，得黄芪 浸出液；(3)将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制成半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗；二者的混合比 例为每毫升黄芪浸出液中加入的灭活菌体为8X101(lcellS。使用时采用注射免疫的方法，取体长为15-20cm的半滑舌鳎按0. ImL/尾的免疫剂 量进行初次注射免疫，后每隔一周按前述免疫剂量加强免疫1次，共免疫4次。实施例3。一种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方法，它以半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏 菌BHKListonella angui llarum BHl)为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其制备方法步骤如 下(1)将鳗利斯顿氏菌BHl菌株接种在普通营养肉汤培养基上，29°C培养24h，加入 体积终浓度为0. 3%的甲醛29°C灭活48h，得灭活菌体；(2)取黄芪用蒸馏水浸泡45min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药lg/mL，得黄芪 浸出液；(3)将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制成半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗；二者的混合比 例为每毫升黄芪浸出液中加入的灭活菌体为8X101(lcellS。使用时采用口服免疫方法，将硬颗粒饲料用半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗浸泡后投喂， 每天鱼体摄入灭活菌体量为8X 106cellS/g体重，连续投喂一周，隔周后再按前述方法进行 加强免疫一周。实施例4。用实施例1、2和3所述的方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗进行的免 疫实验及其结果。实验时间2010年度2月 5月。实验地点江苏省淮海工学院水产动物病害实验室。实验动物半滑舌鳎。实验疫苗与方法分别使用实施例1、2和3所述的方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病 疫苗和使用方法。免疫期结束后，取按实施例1、2和3所述的疫苗和使用方法进行免疫的半滑舌鳎， 分别用浓度为1. 44X 108CFU/mL的鳗利斯顿氏菌BHl (Listonella angui llarum BHl)菌悬 液注射感染受免半滑舌鳎，感染剂量为0. 3mL。对照组为用浓度1. 44X 108CFU/mL 的鳗利斯顿氏菌 BHl (Listonella angui llarumBHl)菌悬液注射感染未经免疫的半滑舌鳎，感染剂量为0. 3mL。实验结果半滑舌鳎经实验例1、2、3所述的疫苗和使用方法进行免疫后，都能产 生一定的免疫保护力，其中以注射方式免疫效果最好，浸泡、口服及注射三种方式的免疫保 护率分别为45%、40%、90%，见下表
权利要求
1.一种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方法，其特征在于它以半滑舌鳎病原鳗利斯顿 氏菌BHl(Listonella anguillarum BHl)为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其制备方法步骤 如下(1)将鳗利斯顿氏菌(又称鳗弧菌)BH1菌株接种在普通营养肉汤培养基上，28-30°C培 养24h，加入体积终浓度为0. 3%的甲醛28-30°C灭活48h，得灭活菌体；(2)取黄芪用蒸馏水浸泡30-60min后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药lg/mL，得黄芪 浸出液；(3)将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制成半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗；二者的混合比例为 每毫升黄芪浸出液中加入的灭活菌体为8X101(lcellS。
2.一种如权利要求1所述的制备方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的使用方法，其 特征在于它采用浸泡免疫的方法，先将受免半滑舌鳎在充气条件下用质量浓度为8%的 NaCl溶液浸泡3-7min，然后按体积比1 5用水稀释半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗得半滑舌鳎鳗 弧菌病疫苗溶液，再将受免半滑舌鳎放于半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗溶液中充气浸泡lh，5-10 天后按前述方法加强免疫1次。
3.—种如权利要求1所述的制备方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的使用方法，其特 征在于它采用注射免疫的方法，取体长为15-20cm的半滑舌鳎按0. ImL/尾的免疫剂量进 行初次注射免疫，后每隔一周按前述免疫剂量加强免疫1次，共免疫4次。
4.一种如权利要求1所述的制备方法制得的半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的使用方法，其特 征在于它采用口服免疫方法，将硬颗粒饲料用半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗浸泡后投喂，每天鱼 体摄入灭活菌体量为8X 106cellS/g体重，连续投喂一周，隔周后再按前述方法进行加强免 疫一周。
全文摘要
本发明是一种半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗的制备方法，其特征在于它以半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌BH1为免疫原，以黄芪浸出液为佐剂；其制备方法步骤如下将鳗利斯顿氏菌BH1菌株接种在普通营养肉汤培养基上培养后，加入甲醛灭活，得灭活菌体；取黄芪用蒸馏水浸泡后煎煮，过滤，浓缩至终浓度为原药1g/ml，得黄芪浸出液；将灭活菌体与黄芪浸出液混合，制成半滑舌鳎鳗弧菌病疫苗。使用本发明方法制备的疫苗并进行半滑舌鳎免疫，能显著提高半滑舌鳎抗鳗弧菌感染的能力，可有效预防半滑舌鳎养殖生产中的鳗弧菌感染，减少半滑舌鳎死亡率，增加半滑舌鳎养殖的产量，保证半滑舌鳎养殖生产的健康和可持续发展，提高半滑舌鳎养殖生产的经济效益。
文档编号A61P31/04GK102100911SQ201010290119
公开日2011年6月22日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者张晓君, 阎斌伦 申请人:淮海工学院