一种灭活鳗弧菌疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种灭活鳗弧菌疫苗的制备方法。本发明首次揭示了包含灭活的鳗弧菌和壳寡糖的新型疫苗，其具有良好的免疫效果，且能达到持久有效的免疫保护效果，制备成本低廉，免疫方法简单易于实际操作。
【专利说明】一种灭活鳗弧菌疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学【技术领域】，更具体地，本发明涉及一种灭活鳗弧菌的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着水产养殖业养殖规模的不断扩大，高密度养殖司空见惯，养殖病害的 大规模爆发在所难免。鱼类传染性疾病每年造成的损失占产量的20%以上，大规模爆发的 疾病已成为水产养殖行业主要的障碍。
[0003] 造成鱼类传染性疾病的主要原因包括细菌、寄生虫以及病毒。弧菌病（vibriosis) 是水产养殖中最常见的细菌性疾病。弧菌病的主要致病菌之一是鳗弧菌（V. anguillarum)， 它可以引起多种鱼类出血性败血症，同时会感染甲壳类和双壳类动物。弧菌病具有流行广 泛、发病率以及死亡率超高等特点，给海水养殖鱼类带来极大威胁。
[0004] 目前在海水养殖生产中一般都是通过化学合成的药物或者抗生素来控制该病的 大规模爆发，但长期的用药出现很多弊端：1)鱼类疾病有时病因复杂，大量用药存在盲目 性，很多疾病目前没有针对性的药物可以治疗；2)化学药物预防作用很弱，生病的鱼摄食 很差，无法摄取到有效的药物剂量；3)鱼体摄取的药物往往会残留其中，危害人类健康，且 长期用药会带来环境污染，并导致大量微生物抗药性的出现。
[0005] 此外，在长期药物的维持下，大量本该淘汰的抗病能力弱的个体存活下来不仅影 响鱼肉的品质，而且会使整个群体抗病能力下降，严重影响海水养殖业的发展。
[0006] 因此，应用免疫学技术开发鱼用疫苗预防鱼类细菌性疾病已成为世界各国研究者 关注的重要内容。目前弧菌病的防治主要依靠弧菌疫苗，其中灭活鳗弧菌疫苗、鳗弧菌减毒 活疫苗以及抗鳗弧菌多价疫苗研究较多，免疫效果参差不齐。并且，还存在一定的毒副作 用，例如有些疫苗佐剂发现会残留在鱼体内（如内脏中），威胁了人们食用的安全性。
[0007] 综上，本领域迫切需要研究和开发新型的效果良好的免疫疫苗，使得养殖鱼类具 备良好的对抗鳗弧菌的免疫能力。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种灭活鳗弧菌的制备方法。
[0009] 在本发明的第一方面，提供一种用于鱼类免疫的疫苗，该疫苗包括：灭活的鳗弧菌 和壳寡糖；所述灭活的鳗弧菌的终浓度为5X 106?3X 108cfu/ml ;所述壳寡糖的终浓度为 0. 05_50mg/mL。
[0010] 在另一优选例中，所述疫苗中，所述灭活的鳗弧菌的终浓度为1X107? 1. 5X108cfu/ml ;更佳地为 2X107 ?8X107cfu/ml。
[0011] 在另一优选例中，所述疫苗中，所述壳寡糖的终浓度为〇. 1-lOmg/mL ;更佳地为 0· 5_5mg/mL〇
[0012] 在另一优选例中，所述的壳寡糖平均分子量在2000左右，脱乙酰度超过90%。
[0013] 在一个优选例中，所述的鳗弧菌的保藏号为CGMCC8644。
[0014] 在本发明的另一方面，提供制备所述的疫苗的方法，所述方法包括：将灭活的 鳗弧菌和壳寡糖混合，获得所述的疫苗；其中，所述灭活的鳗弧菌的终浓度为5X10 6? 3X 108cfu/ml ;所述壳寡糖的终浓度为0. 05-50mg/mL。
[0015] 在一个优选例中，在制备时，配制所述壳寡糖的终浓度为0. 1-lOmg/mL ;更佳地为 0. 5-5mg/mL ;和/或配制所述灭活的鳗弧菌的终浓度为5X 106?3X 108cfu/ml ;较佳地为 1 X 107 ?1. 5 X 108cfu/ml ;更佳地为 2 X 107 ?8 X 107cfu/ml。
[0016] 在另一优选例中，使用甲醛（较佳地甲醛终浓度不超过0.5% )将鳗弧菌灭活，用 生理海水稀释，然后与壳寡糖溶液混合。
[0017] 在另一优选例中，所述的生理海水包括：NaC120g/L ;MgCl2 · 6H204. 8g/L ; MgS04 · 7Η203· 5g/L ;KC10. 7g/L ;NaHC030. llg/L ;CaCl2 · 2Η201· 21g/L。
[0018] 在另一优选例中，鳗弧菌灭活的方法包括：平板培养鳗弧菌，挑取黄色单克隆于 LB20液体培养基，28°C培养12h ;之后以按照体积1%接种量接种于LB20液体培养基，28°C 培养14h，加入终浓度为0. 5%的甲醛，28°C灭活48h。
[0019] 在本发明的另一方面，提供所述的疫苗的用途，用于制备预防鱼类致病菌感染的 组合物。
[0020] 在一个优选例中，所述的致病菌包括：鳗弧菌，溶藻弧菌，哈氏弧菌。
[0021] 在本发明的另一方面，提供壳寡糖的用途，用于与鳗弧菌混合制备鱼类免疫用的 疫苗。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种用于鱼类免疫的药盒，所述药盒中包括所述的疫 苗。
[0023] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1、单独壳寡糖的免疫增强效果分析。
[0025] 图2、灭活鳗弧菌以及壳寡糖各免疫组注射免疫斑马鱼1个月对野生鳗弧菌的相 对免疫保护力。
[0026] 图3、灭活鳗弧菌以及壳寡糖各免疫组注射免疫大菱鲆4、8和12周对野生鳗弧菌 的相对免疫保护力。
[0027] 图4、灭活鳗弧菌以及壳寡糖各免疫组注射免疫大菱鲆4、8和12周血清抗体水平 以及交叉免疫分析。
[0028] 图5、灭活鳗弧菌与佐剂混合免疫3个月后，免疫组以及对照组佐剂残留情况。
【具体实施方式】
[0029] 本发明人经过深入的研究，首次揭示了包含灭活的鳗弧菌和壳寡糖的新型疫苗。 将鳗弧菌和壳寡糖以合理的比例制备成的疫苗，经过针对多种鱼类的试验，证实其具有良 好的免疫效果，能达到持久有效的免疫保护效果，并且在鱼体内没有残留、易于给药，制备 成本低廉，免疫方法简单易于实际操作。
[0030] 壳寡糖
[0031] 本发明人长期致力于鱼类免疫疫苗的研究，在深入研究中发现，制备疫苗的过程 中，免疫佐剂的选择是非常重要的因素。有些免疫佐剂尽管具有促进免疫原的免疫原性的 作用，但是其会发生一些毒副作用，例如残留在鱼肉中或内脏中。有些佐剂因为剂型关系 (如为油性佐剂），注射给药困难，不适用于大规模养殖鱼类的给药。因此，本发明人进行了 大量的筛选研究，最终提供了一种包含灭活的鳗弧菌和壳寡糖的新型疫苗，其中鳗弧菌和 壳寡糖以合理的比例混合。该疫苗在体内残留少，易于给药且免疫效果良好。
[0032] 壳寡糖又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是将壳聚糖经降解技术（例如藉由生物酶技 术或微波降解技术）降解得到的一种聚合度在2?20之间寡糖产品。其水溶性较好。
[0033] 现有技术中，一般将壳寡糖应用于食品添加剂、饲料添加剂、日用化工等领域。而 在药学或兽药学领域中，并没有将之作为免疫佐剂的先例。
[0034] 作为本发明的优选方式，所述壳寡糖的平均分子量在2000左右，脱乙酰度超过 90 %，易溶于水。在制备时，可将壳寡糖用生理海水配成的溶液用0.22 μ m的滤膜过滤除 菌，备用。
[0035] 作为本发明的优选方式，将壳寡糖与灭活的鳗弧菌混合来制备的疫苗，免疫效果 特别理想，对于体液免疫有良好的促进效果。
[0036] 鳗弧菌抗原
[0037] 鳗弧菌为本领域已知的造成鱼类传染性疾病的菌。本发明中，所述的"灭活鳗弧 菌"还包括"减毒鳗弧菌"。
[0038] 可以应用本领域已知的方法来制备灭活的鳗弧菌或减毒的鳗弧菌。作为本发明的 优选方式，使用甲醛（较佳地甲醛终浓度不超过0.5%)将鳗弧菌灭活，用生理海水稀释， 然后与壳寡糖溶液混合。更具体地，鳗弧菌灭活的方法包括：平板培养鳗弧菌，挑取黄色单 克隆于LB20液体培养基，28°C培养12h ;之后以按照体积1%接种量接种于LB20液体培养 基，28°C培养14h，加入终浓度为0. 5%的甲醛，28°C灭活48h。
[0039] 疫苗及其制备
[0040] 本发明还提供一种组合物，优选的是组合物是疫苗，所述的疫苗是指将本发明的 灭活鳗弧菌和药学上可接受的载体混合后获得的可用于预防致病菌感染的疫苗。所述的药 学上可接受的载体是壳寡糖。所述的疫苗可用于鱼类，通常可制成注射剂的形式。
[0041] 本发明中，所述的"致病菌"是指感染鱼类的一类细菌。作为本发明的优选方式， 所述的致病菌包括但不限于：鳗弧菌（V. anguillarum)，溶藻弧菌（V. alginolyticus)，哈 氏弧菌（V. harveyi)。
[0042] 作为本发明的优选方式，所述的疫苗可以包括：灭活鳗弧菌和有效量的壳寡糖作 为免疫佐剂。
[0043] 作为本发明的优选方式，所述疫苗中，所述灭活的鳗弧菌的终浓度为5X106? 3X10 8cfu/ml ;较佳地为 1X107 ?1. 5X108cfu/ml ;更佳地为 2X107 ?8X107cfu/ml ;所 述壳寡糖的终浓度为〇· 02-100mg/mL ;较佳地为0· 05-50mg/mL ;更佳地为0· 1-lOmg/mL(进 一步更佳地为0. 5-5mg/mL)。上述浓度下具有较好的给药效果，能够在鱼体内产生很高效价 的抗体。
[0044] 本发明制备鳗弧菌的方法免疫效果显著，在斑马鱼以及大菱鲆上均得到证实，免 疫以后的大菱鲆血清抗体效价明显提高，并对溶藻弧菌和哈氏弧菌具有一定交叉免疫保护 效果。
[0045] 在本发明的具体实施例中，用灭过菌的生理海水稀释至所需注射斑马鱼以及大菱 鲆的浓度备用。在斑马鱼上，将灭活鳗弧菌按照上述方法将终浓度控制在8X 107cfu/ml， 2mg/ml壳寡糖等体积混合，5 μ 1/尾注射斑马鱼，免疫一个月，免疫保护效果可以达到90% 左右；在大菱鲆上，将灭活鳗弧菌按照上述方法将终浓度控制在4 X 108cfu/ml，壳寡糖用生 理海水配成2mg/ml，等体积混合，0. lml/尾注射大菱鲆，三个月的免疫保护效果可以达到 100 %。壳寡糖的加入，血清抗体水平明显提高，增强了宿主的体液免疫效果。
[0046] 本发明的疫苗，可以被制备成药盒或试剂盒的形式，以便于本领域技术人员使用。 可选地在其中还包括使用说明书。
[0047] 本发明的技术方案的主要优点在于：
[0048] (1)应用壳寡糖与鳗弧菌以合适的比例混合，可显著地提高免疫保护力，鱼体内可 获得高效价的抗体，且能达到持久有效的免疫保护效果。
[0049] (2)壳寡糖可以溶解于水性溶剂中，给药方便，有利于大规模应用。
[0050] (3)壳寡糖易于被鱼类吸收代谢，在鱼体内没有残留。
[0051] (4)本发明的疫苗制备成本低廉，免疫方法简单易于实际操作。
[0052] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0053] 实施例1、灭活鳗弧菌的制备
[0054] 首先，灭活鳗弧菌（保藏号CGMCC8644)的制备方法：从-80°C拿出原始菌液，在 TCBS平板上划线，24-36h后挑取黄色单克隆于5ml LB20液体培养基，28°C培养12h，1% (v/ v)接种量接种于50ml LB20液体培养基，28°C培养14h，加入终浓度为0. 5% (v/v)的甲醛 (实验室所用甲醛溶液为37?40%，即50ml培养物中加入0. 63ml实验室所用的甲醛溶 液），28°C灭活48h，分别取0. lml涂TCBS平板和LB20平板。次日平板没长出菌，表示灭活 彻底。用分光光度计测定0D600,用灭过菌的生理海水稀释至所需浓度备用。
[0055] 其次，与合适浓度的壳寡糖（购自青岛博智汇力生物有限公司）混合，壳寡糖终浓 度为lmg/ml时较适宜。为达到此要求，先用灭过菌的生理海水将壳寡糖配成2mg/ml，将壳 寡糖溶液用〇. 22 μ m的滤膜过滤除菌备用。
[0056] 其中生理海水配方如下（各组分溶于去离子水）：
[0057] NaCl 20g/L ；
[0058] MgCl2 · 6H20 4. 8g/L ；
[0059] MgS04 · 7H20 3. 5g/L ；
[0060] KC1 0. 7g/L ；
[0061] NaHC03 0. llg/L ；
[0062] CaCl2 · 2H20 1. 21g/L ；
[0063] 配制后在121 °C下，灭菌20分钟，备用。
[0064] 实施例2、单独壳寡糖的免疫增强作用研究
[0065] 用灭过菌的生理海水作为对照组（Control)，将壳寡糖用生理海水配制成lmg/ ml，用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌作为免疫组（COS)，每组20尾大菱鲆，腹腔注射0. lml，免疫 后1个月，用野生鳗弧菌MVM425肌肉注射攻毒，攻毒后14天观察累计死亡情况，结果见图 1〇
[0066] 结果显示，C0S组比对照组死亡率稍低，显示出一定的免疫增强效果，但这种增强 效果对于野生鳗弧菌的抵抗作用很弱，免疫保护力在10%左右。
[0067] 实施例3、注射免疫斑马鱼
[0068] 将灭活鳗弧菌（保藏号CGMCC8644)按照上述方法将终浓度控制在8 X 107cfu/ml， 为了比较免疫保护效果，免疫组设定如下：
[0069] 1)灭活鳗弧菌组（V. anguillarum) :8X 107cfu/ml鳗弧菌与生理海水等体积混 合；
[0070] 2)灭活鳗弧菌 + 壳寡糖（V. anguillarum+COS) (10mg/ml) :8X 107cfu/ml 鳗弧菌与 20mg/ml壳寡糖等体积混合；
[0071] 3)灭活鳗弧菌 + 壳寡糖（V. anguillarum+COS) (lmg/ml) :8X 107cfu/ml 鳗弧菌与 2mg/ml壳寡糖等体积混合；
[0072] 4)灭活鳗弧菌 + 壳寡糖（V. anguillarum+COS) (0· lmg/ml) :8X 107cfu/ml 鳗弧菌 与0. 2mg/ml壳寡糖等体积混合。
[0073] 壳寡糖用生理海水配制成相应浓度，然后用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌，备用。实验 组与对照组每组均30尾，设定3个平行组。免疫组同样5 μ 1/尾注射斑马鱼，每个免疫组 中灭活鳗弧菌的剂量均为2Χ 105cfu/尾，免疫后一个月利用野生株鳗弧菌MVM425进行攻 毒，观察攻毒后两周累计死亡情况，并计算各免疫组的免疫保护力（RPS)。
[0074]
【权利要求】
1. 一种用于鱼类免疫的疫苗，其特征在于，该疫苗包括：灭活的鳗弧菌和壳寡糖； 其中，所述灭活的鳗弧菌的终浓度为5X10 6?3X108cfu/ml ;所述壳寡糖的终浓度为 0. 05_50mg/mL。
2. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中，所述灭活的鳗弧菌的终浓度为 1 X 107 ?1. 5 X 108cfu/ml ;更佳地为 2 X 107 ?8 X 107cfu/ml。
3. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中，所述壳寡糖的终浓度为 0· 1-lOmg/mL ;更佳地为 0· 5_5mg/mL。
4. 如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的壳寡糖平均分子量在2000左右，脱乙 酰度超过90%。
5. 制备权利要求1所述的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：将灭活的鳗弧菌和 壳寡糖混合，获得所述的疫苗；其中，所述灭活的鳗弧菌的终浓度为5X10 6?3X108cfu/ ml ;所述壳寡糖的终浓度为0. 05-50mg/mL。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，在制备时，配制所述壳寡糖的终浓度为 0·1-lOmg/mL ;和 / 或 配制所述灭活的鳗弧菌的终浓度为5X 106?3X 108cfu/ml。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用甲醛将鳗弧菌灭活，用生理海水稀释， 然后与壳寡糖溶液混合。
8. 权利要求1-4任一所述的疫苗的用途，用于制备预防鱼类致病菌感染的组合物。
9. 壳寡糖的用途，其特征在于，用于与鳗弧菌混合制备鱼类免疫用的疫苗。
10. -种用于鱼类免疫的药盒，其特征在于，所述药盒中包括权利要求1-4任一所述的 疫苗。
【文档编号】A61K39/39GK104208672SQ201410201335
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】吴海珍, 高原, 王启要, 刘琴, 张元兴 申请人:华东理工大学