一种鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗的制备方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的各年龄段鸡或火鸡的常见多发性传染病。该病 自1899年首次发现，目前已呈世界范围流行，造成养禽业的重大损失。20日龄以内的雏鸡 感染鸡白痢沙门氏菌后，通常引发急性败血症，死亡率高达80%~100%。目前国内通常采用 药物控制的方法减轻疫病的危害，但长期反复用药不仅使饲养成本上升，而且导致细菌耐 药性增强以及药物残留等一系列问题，事实证明仅依赖药物控制不是防治鸡白痢的上选对 策。相比而言，采用疫苗免疫，既不会造成细菌耐药性增强，也不会产生药物残留，因而更容 易被广大养殖者和消费者接受。灭活疫苗具有安全性好，抗原含量高，生产工艺简单等优 点，在传染病防治中得到广泛的应用。但是传统的灭活疫苗由于免疫原性不强，通常需重复 接种，导致免疫力产生较慢，且鸡白痢沙门氏菌包含三种不同亚型(标准型、中间型和变异 型)，而不同亚型间的交叉保护性不高，因而给疫苗研制带来了较大的难度，目前尚未出现 能够尚效防治鸡白病的灭活疫苗广品。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的旨在提供一种用于预防鸡白痢沙门氏菌的灭活疫苗的制备方法。
[0004] 本发明的原理是从历年来收集、保存的500余株自然病例所分离的鸡白痢沙门氏 菌菌种中，经多年反复筛选验证后获得的三株不同亚型的、免疫原性良好的鸡白痢沙门氏 菌菌种SP7220 (中间型)、SP8441 (变异型）和SP9905 (标准型）作为制苗菌种，经培养灭活 后采用新型佐剂配方制备疫苗，解决了传统灭活疫苗免疫力产生较慢、细胞免疫保护功能 弱、交叉保护性不强等缺点，全面提升疫苗的免疫效力。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现： 一种用于预防鸡白痢沙门氏菌的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤： 1) 种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220、SP8441和SP9905复苏繁殖后，接 种平板固体培养基，37°C培养24h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37°C培养24h后用 液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液； 2) 半成品制备：将种子菌液按培养基总体积的3. 0%接种，经发酵罐37°C深层通气培养 12h后，收集菌液，经5000r/min离心15min去除上清液，用含有0. 3%甲醛的生理盐水重新 悬浮菌泥，置8°C灭活12h，制成半成品； 3) 疫苗制备：将半成品与含有0. 5mg/ml壳聚寡糖、0. 75mg/ml刺五加多糖和20mg/ml 蜂胶的佐剂等体积充分搅拌混匀，经无菌检验和安全性检验合格后分装制成鸡白痢沙门氏 菌灭活疫苗。
[0006] 所述的鸡白病沙门氏菌（Salmonella pullorum) SP7220、SP8441、SP9905 均已于 2014年10月15日送中国典型培养物保藏中心（中国.武汉.武汉大学）保藏，保藏编号 分别为：CCTCC NO. M 2014476、CCTCC NO. M 2014477、CCTCC NO. M 2014478。
[0007] 所述的液体培养基组成为：蛋白胨15. 0g、酵母浸出粉5. 0g、甘油12. 0ml、硫代硫 酸钠5. 0g、甘露醇3. 0ml、可溶性淀粉6. 0g、硫酸镁0. 5g、氯化妈0. 3g、半胱氨酸I. 0g、牛胆 盐5. 0g、葡萄糖8. 0g、蒸馏水1000ml。
[0008] 液体培养基中加入1. 5%纯化琼脂粉制成固体培养基。
[0009] 所述的深层通气发酵培养为37°C条件下采用逐渐加大通气量的方式培养12h。
[0010] 本发明方法所生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗所含有的细菌浓度为每毫升100 亿，其中含有鸡白痢沙门氏菌3?7220、3?8441和3?9905的细菌数量分别为30%、20%和50%。
[0011] 本发明还要求保护上述所述的鸡白痢沙门氏菌SP7220、SP8441、SP9905。
[0012] 本发明的另一目的还在于通过本发明方法制备得到的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗。
[0013] 本发明的另一目的还在于上述鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗在预防或治疗鸡白痢药 物中的用途。
[0014] 本发明的有益效果为：本发明方法所生产的鸡白痢沙门氏菌灭活疫苗，具有产量 高、产品安全可靠，疫苗免疫后在第7天即可产生较好的免疫保护力，在第10天可产生坚强 保护力，免疫保护率达100%，并且对不同亚型的鸡白痢沙门氏菌和其它血清型沙门氏菌的 攻击具有较好的保护能力。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0016] 实施例1 1)分离纯化与染色镜检 鸡白痢沙门氏菌SP7220株于1972年11月从山东省青岛市某鸡场死亡的白来航雏鸡 肝脏中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集死亡雏鸡的肝脏置营养肉汤中37°C过夜培 养后，再接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。挑取直径为1.0 mm-2. 0_、灰白色透明、 表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰 氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0017] 鸡白痢沙门氏菌SP8441株于1984年12月从北京市某鸡场的6月龄白来航蛋鸡 输卵管中分离所得。其具体分离方法为：无菌剪取输卵管一小段加入营养肉汤中37°C过夜 培养，再接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。挑取直径为1.0 mm-2. 0_、灰白色透明、 表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37°C培养24小时。将纯培养后的细菌进行革兰 氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0018] 鸡白痢沙门氏菌SP9905株于1999年5月从江苏省扬州市某鸡场的11月龄狼山 鸡盲肠内容物中分离所得。其具体分离方法为：无菌采集盲肠内容物加入亚硒酸盐胱氨酸 增菌液中37°C过夜培养，再接种麦康凯琼脂37°C培养24小时，挑取直径为0. 5mm-l. 0mm、灰 白色透明、表面光滑的菌落，接种于马丁琼脂培养基，37 °C培养24小时。将纯培养后的细菌 进行革兰氏染色镜检，然后用光学显微镜观察，呈两端稍圆的细长杆菌。
[0019] 2)生化鉴定 从马丁琼脂平板上挑取菌落，进行生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试 剂有限公司，按照说明书进行操作。结果菌株的各项生化指标(见表1)均符合鸡白痢沙门 氏菌生化特性。
从马丁琼脂平板上挑取菌落至生理盐水中，用比浊法调整细菌浓度至每毫升 LOX IOwCFU,采用玻片凝集的方法对菌株进行血清学分型鉴定。具体操作方法如下：取洁 净玻片1张，用微量移液器吸取25 y 1沙门氏菌阳性血清（除0122和012 3购自中国兽医药 品检查所外，其余血清均购自丹麦哥本哈根国立血清研究所）滴于载玻片上，另吸取25 y 1 生理盐水做对照，然后吸取25 y 1菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀。轻轻摇动载 玻片，2min后判定结果。检测结果如表2 :SP9905为标准型，SP7220为中间型，SP8441为 变异型。
注："++++"代表100%凝集，"+++"代表75%凝集，"++"代表50%凝集，" + "代表25%凝 集，代表未发生凝集。
[0022] 下面结合具体实施例说明成上述鸡白痢沙门氏菌制备的活疫苗及方法。
[0023] A?培养基配置： 液体培养基组成为：蛋白胨15. 0g、酵母浸出粉5. 0g、甘油12. 0ml、硫代硫酸钠5. 0g、甘 露醇3. 0ml、可溶性淀粉6. 0g、硫酸镁0. 5g、氯化妈0. 3g、半胱氨酸I. 0g、牛胆盐5. 0g、葡萄 糖8. 0g、蒸馏水1000ml。
[0024] 液体培养基中加入1. 5%纯化琼脂粉制成固体培养基。
[0025] B.鸡白痢沙门氏菌的灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤： 1) 种子菌液的制备：将鸡白痢沙门氏菌菌种SP7220、SP8441和SP9905复苏繁殖后，接 种平板固体培养基，37°C培养24h，挑选典型菌落接种扁瓶固体培养基，37°C培养24h后用 液体培养基洗下菌苔，检验合格后作为种子菌液； 2) 半成品制备：将种子菌液按培养基总体积的3. 0%接种，经发酵罐37°C深层通气培养 (37°C条件下采用逐渐加大通气量的方式培养）12h后，收集菌液，经5000r/min离心15min 去除上清液，用含有0. 3%甲醛的生理盐水重新悬浮菌泥，置8°C灭活12h，制成半成品； 3) 疫苗制备：将半成品与含有0. 5mg/ml壳聚寡糖、0. 75mg/ml刺五加多糖和20mg/ml 蜂胶的佐剂等体积充分搅拌混匀，经无菌检验和安全性检验合格后分装制成鸡白痢沙门氏 菌灭活疫苗。