以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备及其应用，该疫苗的制备包括以下步骤：(1)首先通过分子生物学方法构建整合了微基因与自转运系统的重组疫苗载体；(2)将步骤(1)所述的重组疫苗载体电转化入减毒沙门氏菌SL7207中，构建出重组口服肿瘤疫苗。本发明首次将微基因与自转运系统整合到同一个载体上，通过电转化沙门氏菌获得了口服肿瘤疫苗，通过小鼠肿瘤模型，验证了该疫苗对肿瘤的免疫预防效果；从而可以将其应用在制备肿瘤的免疫预防药物领域中。
【专利说明】以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小鼠肿瘤疫苗的制备，特别涉及一种以减毒沙门氏菌为载体的基于微基因与自转运系统的口服肿瘤疫苗的制备及其应用。
【背景技术】
[0002]免疫系统主要通过⑶8+ T细胞介导细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicity Tlymphocyte, CTL)效应来杀灭肿瘤细胞。越来越多的研究表明，⑶4+ T细胞在抗肿瘤免疫方面也起着关键的作用。⑶4+ T细胞可通过TRAIL依赖机制控制记忆性⑶8+ T细胞的产生，肿瘤特异性的CD4+ T细胞能维持CD8+ T细胞的免疫记忆、提高CD8+ T细胞的肿瘤浸润水平。然而，目前往往需要将多种疫苗联合使用，才能诱导出高水平的CD4+和CD8+ T细胞应答；而且，目前设计的疫苗往往需要通过注射的途径进行多次免疫，这些都限制了肿瘤疫苗的实际应用。
[0003]肿瘤的微基因疫苗是将肿瘤的多个表位串联构建而成的DNA疫苗。该疫苗胞内合成抗原，易被MHC I类分子递呈，能激发CD8+ T细胞反应。而且，微基因疫苗以表位为基础，去除无关成分，比传统的DNA疫苗效率、纯度和安全性更高。在表位上游加入编码泛素标签基因，可以进一步提高蛋白酶体对表位的降解并可诱导出比传统DNA疫苗更强的CD8+ T细胞反应。
[0004]AIDA-1表面展示系统是一种高效的细菌自转运蛋白系统，由信号肽、N端的“乘客”蛋白及C端的β结构域三个功能区组成。该蛋白的C端β结构域可在革兰氏阴性菌表面形成桶状结构，不需要其它辅助因子和能量，即可通过桶状结构将其N端的“乘客”蛋白牵引到革兰氏阴性菌的外膜上，展示于细菌表面的抗原，由于空间构象优势，更易被免疫系统识别，能诱导机体产生高水平`的CD4+ T细胞反应。
[0005]微基因疫苗能够激发高水平的⑶8+ T细胞应答，而AIDA-1系统在激发⑶4+ T细胞反应方面亦具有优势，但是目前未见将AIDA-1表面展不系统与微基因疫苗整合于同一肿瘤疫苗载体中的报道。
[0006]另外，活疫苗载体包括病毒及细菌载体，与病毒载体相比，沙门氏菌感染的组织更广，因此可以将抗原递呈到更多的组织部位；而且可以通过抗生素来控制感染的程度和范围，因而比病毒载体更加安全。沙门氏菌可以与DC及巨噬细胞的多种toll样受体(toll-like receptor, TLR)结合,具有免疫佐剂的作用。
【发明内容】
[0007]本发明的发明目的是提供一种以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，由此制备的肿瘤疫苗能同时激发机体高水平的CD4+和CD8+ T细胞应答，可用于制备肿瘤的免疫预防药物。
[0008]本发明的思路为通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1表达元件，将黑色素瘤的Melan-A基因克隆入AIDA-1表达元件中；同时从pVAXl质粒中扩增出CMV真核表达元件，并将泛素化标签和黑色素瘤的2个CD8表位克隆入CMV真核表达元件；将上述的两种表达元件整合到同一个质粒载体中，构建出目标重组质粒；将得到的目标重组质粒电转化入减毒沙门氏菌得到口服肿瘤疫苗。
[0009]为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤:
(1)包含Melan-A抗原的AIDA-1表面展示原件的构建:
通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1表达元件的质粒pMK90，用KpnI和XbalI双酶切该质粒，回收载体大片段；设计特异性引物Seq N0.1和SeqN0.2，以B16细胞的cDNA为模板，扩增出Melan-A基因，分别用KpnI和XbalI双酶切，回收产物并将其与上述回收的载体大片段连接；将连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为pBMA ；
(2)微基因疫苗片段的构建::!；获取CMV真核表达元件:根据PVAXl载体的序列，设计引物Seq N0.3和Seq N0.4，通过PCR扩增出CMV真核表达元件；利用凝胶回收试剂盒回收CMV真核表达元件；将回收所得PCR产物与pMD19-T simple克隆载体连接、4°C连接过夜；取连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为PCMV ；
€泛素化标签与黑色素瘤⑶8表位融合基因的获取:合成引物Seq N0.5和SeqN0.6，以小鼠的肝脏DNA为模板，进行PCR扩增，获得的PCR产物经HindIII和XhoI双酶切，回收产物；
将pCMV用HindIII和XhoI双酶切，回收载体片段，并与::!:中的回收产物连接、转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切`鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为PU ；
(3)整合了微基因与AIDA-1自转运系统的重组疫苗载体的构建:
用AgeI分别酶切pU与pBMA，然后将pU经AgeI酶切后的小片段及pBMA经AgeI酶切后的大片段分别回收并连接，连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒为目标载体PV ;
(4)以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备:通过电转化的方法将pV转化入减毒沙门氏菌SL7207，通过PCR鉴定出阳性转化子，即为所述的以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗；
所述引物 Seq N0.1 为 ggtacctgccccaagaagaca ；
Seq N0.2 为 tctcagaggtgaataaggtggc ；
Seq N0.3 为 accggtggagttccgcgttaca ；
Seq N0.4 为 accggtcagtagaagccatagag ；
Seq N0.5 为 aagcttatgcagatctttgtgaag ；
Seq N0.6 为:ctcgagtcataaccacacaaaaaaatcgtacactgagtaagcagctaataaatggtaccgatgccagttagcaccccgaagtctcaac。
[0010]上述技术方案中，步骤(1)中，以B16细胞的cDNA为模板，PCR扩增出Melan-A基因的条件为:94°C 4min ；94°C 15s，62°C 30s, 72°C lmin，3 个循环；94°C 15s，60°C 30s,72°C lmin，5 个循环；94°C 15s,58°C 30s, 72°C lmin，5 个循环；94°C 15s, 56°C 30s,72°C lmin，5 个循环；94°C 15s, 54°C 30s,72°C lmin，25 个循环；72°C IOmin ；12°C30min ;步骤⑵中，PCR扩增出CMV真核表达元件的条件为:94°C 4min ；94°C 30s,62°Clmin，72°C 2min，3 个循环；94°C 30s, 60°C lmin，72°C 2min，5 个循环；94°C 30s, 58°Clmin,72°C 2min，5个循环；94。0 30s, 56°C lmin,72°C 2min，5个循环；94。0 30s,54°Clmin，72°C 2min，25 个循环；72°C IOmin ；12°C 30min ;步骤⑵中，以小鼠肝脏 DNA 为模板扩增泛素化标签与黑色素瘤⑶8表位融合基因，条件为:94°C 4min ；94°C 30s, 62°C45s, 72°C 1111丨11，3个循环；941: 30s, 60°C 45s, 72°C lmin，5 个循环；94°C 30s,58°C 45s,72°C lmin，5 个循环；94°C 30s, 56°C 45s, 72°C lmin，5 个循环；94°C 30s,54°C 45s, 72°Clmin，25个循环；72°C IOmin ；12°C 30min ;步骤(3)中，pV电转化入沙门氏菌的具体方法为:取IOmL对数生长期的沙门氏菌，4°C以1500g~2000g的离心力离心lOmin，弃去上清；用20mL O~4°C含有10%甘油的无菌超纯水的WB缓冲液重悬沉淀；4°C以1500g~2000g的离心力离心lOmin，弃去上清；用10mLO~4°C的WB缓冲液重悬沉淀；4°C以1500g~2000g的离心力离心lOmin，弃去上清，用1mL O~4°C的WB缓冲液重悬沉淀；取50uL的悬液加入到冰浴的0.2cm电转杯中，再加入20pg~0.1mg的pV质粒,混匀；将电转杯放入Bio-Rad Gene Pulser仪中，以2.5 kV，25 mF, 200 V的条件进行电击；取出电转杯，并加入ImL的LB培养基混匀，转移至IOmL的试管中，于37°C摇床中培养60~90min，取IOOmL的菌液涂布于含50~100mg/mL氨节西林的固体LB平板，即完成了电转化。
[0011]上述技术方案中，根据NCBI所公布的Melan-A序列BC111114.1设计特异性引物Seq N0.1和SeqN0.2 ;根据pVAXl载体的序列，设计了针对CMV真核表达元件的引物SeqN0.3和Seq N0.4 ;根据小鼠泛素标签序列NM_024277.2及黑色素瘤⑶8表位TWHRYHLL与SVYDFFVWL，合成了一对引物Seq N0.5和Seq N0.6，CD8两个表位间以AAY相连，即TffHRYHLLAAYSVYDFFVffL。
[0012]上述引物的序列号如下:
【权利要求】
1.一种以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)包含Melan-A抗原的AIDA-1表面展示原件的构建: 通过PCR方法从大肠杆菌E393中扩增出AIDA-1表达元件的质粒pMK90，用KpnI和XbalI双酶切该质粒，回收载体大片段；设计特异性引物Seq N0.1和SeqN0.2，以B16细胞的cDNA为模板，PCR扩增出Melan-A基因，分别用KpnI和XbalI双酶切，回收产物并将其与上述回收的载体大片段连接；将连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命SSpBMA; (2)微基因疫苗片段的构建: I)获取CMV真核表达元件:根据PVAXl载体的序列，设计引物Seq N0.3和Seq N0.4，通过PCR扩增出CMV真核表达元件；利用凝胶回收试剂盒回收CMV真核表达元件；将回收所得PCR产物与pMD19-T simple克隆载体连接、4°C连接过夜；取连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为PCMV ； I:泛素化标签与黑色素瘤⑶8表位融合基因的获取:合成引物Seq N0.5和Seq N0.6，以小鼠肝脏DNA为模板扩增泛素化标签与黑色素瘤CD8表位融合基因，获得的PCR产物经HindIII和XhoI双酶切，回收产物； 将PCMV用HindIII和XhoI双酶切，回收载体片段，并与2;中的回收产物连接、连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒命名为PU ； (3)整合了微基因与AIDA-1自`转运系统的重组疫苗载体的构建: 用AgeI分别酶切pU与pBMA，然后将pU经AgeI酶切后的小片段及pBMA经AgeI酶切后的大片段分别回收并连接，连接产物转化至DHlOB的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；取该质粒进一步测序鉴定其编码基因序列，取测序鉴定正确的阳性质粒为目标载体PV ; (4)以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备:通过电转化的方法将pV转化入减毒沙门氏菌SL7207，通过PCR鉴定出阳性转化子，即为所述的以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗；
所述引物 Seq N0.1 为 ggtacctgccccaagaagaca ；
Seq N0.2 为 tctcagaggtgaataaggtggc ；
Seq N0.3 为 accggtggagttccgcgttaca ；
Seq N0.4 为 accggtcagtagaagccatagag ；
Seq N0.5 为 aagcttatgcagatctttgtgaag ；
Seq N0.6 为:
ctcgagtcataaccacacaaaaaaatcgtacactgagtaagcagctaataaatggtaccgatgccagttagcaccccgaagtctcaac。
2.根据权利要求1所述以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于:步骤⑴中，以B16细胞的cDNA为模板，PCR扩增出Melan-A基因的条件为:94°C4min ；94°C 15s,62°C 30s, 72°C Imin，3个循环；94。0 15s,60°C 30s, 72°C Imin，5 个循环；94°C 15s，58°C 30s, 72°C Imin，5 个循环；94°C 15s，56°C 30s，72°C Imin，5 个循环；94°C 15s,54°C 30s,72°C Imin，25 个循环；72°C IOmin ；12°C 30min。
3.根据权利要求1所述以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增出CMV真核表达元件的条件为:94°C 4min ；94°C 30s,62°C lmin,72°C 2min，3 个循环；94°C 30s, 60°C lmin,72°C 2min，5个循环；94。0 30s, 58°C lmin,72°C 2min，5个循环；94。0 30s, 56°C lmin,72°C 2min，5个循环；94。0 30s,54°C lmin,72°C 2min，25 个循环；72°C IOmin ；12°C 30min。
4.根据权利要求1所述以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤⑷中，PV电转化入沙门氏菌的具体方法为:取IOmL对数生长期的沙门氏菌，4°C以1500g~2000g的离心力离心lOmin，弃去上清；用20mL O~4°C含有10%甘油的无菌超纯水的WB缓冲液重悬沉淀；4°C以1500g~2000g的离心力离心lOmin，弃去上清；用IOmLO~4°C的WB缓冲液重悬沉淀；4°C以1500g~2000g的离心力离心lOmin，弃去上清，用ImL O~4°C的WB缓冲液重悬沉淀；取50uL的悬液加入到冰浴的0.2cm电转杯中，再加A 20pg~0.1mg的pV质粒，混匀；将电转杯放入Bio-Rad Gene Pulser仪中，以2.5 kV,25 mF, 200 V的条件进行电击；取出电转杯，并加入ImL的LB培养基混匀，转移至IOmL的试管中，于37°C摇床中培养60~90min，取IOOmL的菌液涂布于含50~100mg/mL氨苄西林的固体LB平板，即完成了电转化。
5.根据权利要求1所述以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，以小鼠肝脏DNA为模板扩增泛素化标签与黑色素瘤CD8表位融合基因，条件为:94°C 4min ；94°C 30s, 62°C 45s, 72°C lmin，3 个循环；94°C 30s, 60°C 45s,72°C lmin，5个循环；94。0 30s, 58°C 45s, 72°C lmin，5 个循环；94°C 30s, 56°C 45s, 72°Clmin，5 个循环；94°C 30s,54°C 45s, 72°C lmin，25 个循环；72°C IOmin ；12°C 30min。
6.采用权利要求1所述以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗的制备方法制备得到的以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗。
7.权利要求6所述以减毒沙门氏菌为载体的口服肿瘤疫苗在制备肿瘤预防及治疗药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述肿瘤为黑色素瘤。
【文档编号】A61K39/00GK103550789SQ201310600070
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】赵李祥, 梅雨, 刘海燕 申请人:苏州大学