减毒猪链球菌疫苗及其制造和使用方法
【专利说明】
[0001] 通过引用方式并入
[0002] 本申请要求2012年6月27日提交并通过引用方式完整并入本文的临时申请USSN 61/664,935的优先权。
技术领域
[0003] 本发明一般地涉及减毒细菌疫苗，尤其向猪提供宽泛、安全和有效保护免遭猪链 球菌（Streptococcus suis)所致感染/疾病的那些。本发明还涉及产生减毒细菌的方法， 并涉及鉴定与减毒细菌毒力降低相关的核酸变异。
[0004] 本发明因此涉及包含本发明细菌（例如，减毒活细菌）的免疫原性或疫苗组合物。 这些细菌还可以在组合物中是灭活的；但是可能有利的是细菌是减毒活猪链球菌细菌。因 此，发明还涉及用于制备和/或配制这类组合物的方法；例如，在合适培养基上或其中培养 或培育或增殖细菌，收获细菌，任选地灭活细菌，并且任选地将细菌与合适的可兽用或可药 用载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂混合。因此，本发明还涉及所述 细菌在配制这类组合物中的用途。
[0005] 发明背景
[0006] 猪链球菌是优势定居于猪的革兰氏阳性球菌。尽管成年猪充当无症状携带者，但 是它可以在仔猪中造成致命性脑膜炎、脓毒关节炎和支气管肺炎。成年猪通常在其扁桃体 隐窝和上呼吸道中携带猪链球菌作为共生体，但是细菌也已经从胃肠道和生殖道分离。几 乎全部成年猪均充当猪链球菌的储存宿主且这种病原体在世界范围影响猪产业。
[0007] 此外，猪链球菌还定居于广泛类型的哺乳动物和禽类物种[Gottschalk等人， 2007]。另外，猪链球菌是重要的动物传染病因素[Perch等人，1968]，不过在欧洲和北美洲 罕见人感染猪链球菌。北美洲和欧洲中这些病例大部分几乎完全与职业性暴露于猪或猪肉 产品相关。但是，人感染猪链球菌的发生率在东南亚和中国更高。虽然脑膜炎是人类中最 常见的表现，但还见偶发性败血症和心内膜炎。
[0008] 33个已知的猪链球菌血清型当中，血清型2与来自北美洲和欧洲的猪中的脑膜 炎和关节炎最频繁相关[Fittipaldi等人，2009 ;Higgins和Gottschalk，2006]。各种猪 链球菌毒力因子包括荚膜、纤连蛋白/纤维蛋白原结合蛋白、血清浑浊样因子和细胞壁脂 磷壁酸及肽聚糖修饰[Baums等人，2006 ;Chabot_Roy等人，2006 ;de GreefT等人，2002 ; Fittipaldi等人，2008a，b ;Smith等人，1999]。另外，相同血清型的多种菌株之间共有的毒 力因子显示广泛变异性[Berthelot-Herault等人，2005 ;Quessy等人，1995 ;Vecht等人， 1992]。猪链球菌毒力的表型标记包括溶血因子溶血素（由sly编码）、称作胞壁酸酶释放蛋 白的LPXTG蛋白[MRP，136kDa，由基因mrp编码]和分泌型蛋白胞外因子[EF，llOkDa，由基 因印f编码]。在这些毒力蛋白的存在和猪链球菌欧亚菌株中强毒表型之间存在强烈正相 关[Gottschalk等人，2007 ;Vecht等人，1991]。在这些大陆，血清型2MRP+EF+SLY+菌株主要 从显示疾病严重临床体征的患病猪分离，而MRP飞rSLY^菌株经常从健康猪分离[Allgaier 等人，2001 ;Vecht 等人，1992]。
[0009] 完整细胞和许多猪链球菌蛋白已经作为潜在疫苗候选物研宄。用野生型菌苗免 疫完全保护对抗同源血清型攻击，而无荚膜的突变体未能提供保护作用[Wisselink等人， 2002]。在Li等人实施的研宄中，与Quil A组合的重组SAO(猪链球菌表面蛋白）在猪中 保护免遭猪链球菌血清型2病。用SAO肌内免疫激发出明显的体液抗体反应，但是优势地 是IgG2。重组SAO免疫还引起调理吞性（opsonophagocytic)抗体[Li等人，2007]。用 从猪链球菌菌株PlA (血清型2)纯化的溶血素免疫仔猪，增加了中和抗体滴度，显示SLY 可能作为保护性抗原发挥作用[Jacobs等人，1996]。然而，这些实验均未使用异源血清型 攻击用这些抗原接种的猪。在Baums等人的研宄中，猪链球菌血清型2菌苗诱导对抗同源 攻击的保护性免疫。与之相反，MAP亚基疫苗的保护效力低，不过MP免疫产生针对MRP和 SAO的高血清IgG2滴度。重要地，用菌苗而不用MAP免疫诱导针对血清型2菌株的调理抗 体滴度，并且发现这些抗体滴度与保护作用相关。然而，用无荚膜同基因突变体吸附后，来 自菌苗免疫仔猪的血清未能促进嗜中性粒细胞杀伤作用，这表明针对荚膜的抗体可能不是 调理吞作用必需的[Baums等人，2009]。另外，诱导针对血清型9的调理抗体在接受菌苗 的组中或在接受MP疫苗的组中检测不到，导致针对血清型9菌株的保护作用低。
[0010] 这些接种-攻击研宄均未产生对猪链球菌感染具有广泛保护性的疫苗。另外，在 分子水平关于猪链球菌发病机制的精确理解认识是零散的，这归因于血清型内部各菌株间 庞杂的毒力因子和涉及与其宿主相互作用的复杂分子机制。缺少对抗猪链球菌感染的有效 疫苗是现代猪生产中的主要问题。因此，本公开的主要目的是提供安全和有效的猪链球菌 疫苗。
【发明内容】
[0011] 本发明的一个目的是提供减毒疫苗以及用于治疗和预防猪链球菌所致感染的方 法。
[0012] 本发明还涉及新的猪链球菌减毒株，其提供安全、有效和宽泛保护性免疫。相对于 亲本猪链球菌菌株，该减毒株可以具有其存在与毒力降低相关的一个或多个多态性变异核 苷酸。
[0013] 本发明提供相对于野生型/亲本细菌在一个或多个核酸序列中包含突变的突变 细菌，所述突变使得突变细菌相对于亲本细菌减毒，所述亲本细菌包含核酸，所述核酸编码 具有如SEQ ID N0:2、6和10中所述的肽序列的野生型蛋白。在一个具体实施方案中，突变 细菌包含如SEQ ID N0:3、7和11中所示的核酸序列，所述核酸序列编码如SEQ ID N0:4、8 和12中所示的肽并导致突变细菌相对于强毒野生型/亲本细菌是减毒/无毒的。在另一 个实施方案中，突变细菌在如SEQ ID NO: 2、6和10中所示的野生型肽（即，并非如SEQ ID N0:4、8和12中所示的那些生成肽）中具有其他突变，所述其他突变导致突变细菌相对于强 毒野生型/亲本细菌是减毒的。
[0014] 根据一个具体实施方案，菌株可以相对于它们的亲本猪链球菌菌株具有"可变 (alternative)形式的基因"，这些在本文中定义为"等位基因"。在一个实施方案中，可变 等位基因负责降低或减毒的毒力。如本文定义，术语"基因"将以宽泛意义使用，并应当涵 盖编码序列和非编码序列（即上游和下游调节序列、启动子、5'/3'瓜1?、内含子和外显子）。 在意图仅提及基因的编码序列情况下，术语"基因的编码序列"或"CDS"将在本公开自始至 终互换使用。
[0015] 在一个具体实施方案中，减毒株在rpsL-S12(30S核糖体亚基蛋白）、ABC转运蛋 白ATP结合膜蛋白（ABC-ATPBMP)和细菌转录调节蛋白（marR)、全部三者或其组合中具有 一种或多种多态性。在一个实施方案中，减毒株和其亲本株之间存在至少4个核苷酸差异： rpsL-S12 中的 2 个 SNP 以及在 ABC-ATPBMP 和 marR 中的 1 个 SNP。
[0016] 根据另一个方面，本发明涉及基因修饰的猪链球菌菌株，其中rpsL-S12、 ABC-ATPBMP和marR或全部三者的表达相对于亲本猪链球菌菌株改变，导致基因修饰菌株 的毒力降低。
[0017] 根据另一个方面，本发明涉及一种用于产生减毒猪链球菌细菌的方法，包括步 骤：
[0018] (a)在诱变剂存在下培育猪链球菌亲本株；
[0019] (b)接种幸存细胞至适宜的培养基；
[0020] (C)通过注射入猪中检验各个菌落以确定毒力；
[0021] (d)如果猪不出现与亲本株感染相关的临床体征，则确定菌株减毒。
[0022] 在一个实施方案中，减毒疫苗还包含佐剂。佐剂可以是与单独的减毒疫苗相比增 加和/或增进已激发的免疫反应的任何物质。粘膜用佐剂，包括壳聚糖及它们的衍生物，特 别可用于公开的口服减毒疫苗。
[0023] 本发明还提供用于诱导针对猪链球菌的免疫（或免疫原性）反应或保护性反应的 方法，以及用于预防或治疗猪链球菌所致的猪链球菌或疾病状态的方法，包括向有需求的 动物施用减毒细菌或包含该减毒细菌的组合物。
[0024] 还提供至少包含减毒猪链球菌菌株和使用说明书的试剂盒。
[0025] 这些和其他实施方案被公开或从以下发明详细显而易见和由其涵盖。
[0026] 发明详述
[0027] 本发明提供参与减毒作用微生物如细菌（例如，革兰氏阳性细菌，例如，猪链球菌 (猪链球菌（S. suis))的核苷酸序列和基因、由该核苷酸序列编码的产物（例如，蛋白质、抗 原、免疫原、表位）、用于产生这类核苷酸序列、产物、微生物的方法，及其用途，如用于制备 疫苗或免疫原性组合物或用于激发免疫性反应或免疫反应或用作载体，例如，作为表达载 体（例如，体外或体内表达载体）。
[0028] 引入微生物的核苷酸序列和基因中的突变产生新的和非显而易见的减毒突变体。 这些突变体可用于产生具有高度免疫原性的活减毒免疫原性组合物或减毒活疫苗。
[0029] 这些突变体还可用作可以用于表达体外表达产物以及用于核苷酸序列增殖或复 制（例如，DNA复制）、用于体内表达产物的载体。
[0030] 突变的鉴定提供新的和非显而易见的核苷酸序列和基因，以及由该核苷酸序列和 基因编码的新的和非显而易见的基因产物。
[0031] 这类基因产物提供抗原、免疫原和表位，并是可用作分离的基因产物。
[0032] 这类分离的基因产物以及其表位，还可用于产生可用于诊断性应用的抗体。
[0033] 可以提供或产生表位、抗原或免疫原的这类基因产物还可用于免疫原性组合物或 免疫学组合物以及疫苗。
[0034]在一个方面，本发明提供在核苷酸序列或基因中含有减毒突变的细菌，其中突变 调节、减少或消除基因编码的多肽或蛋白质的表达和/或生物活性，导致减毒的细菌毒力。
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