中分别培育。选择这20个培养物中 的一份培养物并注射（1.76X IO9个细胞/ml)至猪中以确定毒力。经口接种10头猪并观 察26天。在这个时间段未观察到与猪链球菌感染一致的临床体征。除高度减毒之外，突变 株还耐受新霉素。另外，对突变/候选疫苗株（SEQ ID NO: 10)以及亲本株（SEQ ID NO:9) 的全基因组完整测序并分析可能赋予无毒力表型的单核苷酸多态性（SNP)。
[0114] 测序。为了对亲本株和突变株的基因组测序，将猪链球菌对数期（log)培养物沉 淀并使用Qiagen DNA mini试剂盒（Qiagen，Valencia，CA)纯化DNA。随后产生基因组DNA 文库（Illumina基因组DNA制备试剂盒，Illumina，圣迭戈，CA)并在单末端流动小室v4用 Cluster Generation Station instrument (Illumina)上进行聚类（cluster)扩增以产生 原始聚类强度~600, 000mm2。使用测序试剂盒试剂（Illumina)，在Genome Analyzer GAII 上进行56个循环测序。序列随后对报告的猪链球菌PlAGenBank基因组序列(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/AM946016. I) (SEQ ID NO: 11)比车交，并且用已知的石角定基 因鉴定同源性。将亲本株和突变株的序列比较以寻找基因编码区中出现的单核苷酸多态性 (SNP)(尽管发明人承认并构思非编码区也可能负责减毒/无毒力表型）。这项分析揭示 出几个SNP并且进一步验证导致（非同义性）氨基酸变化的那些。根据建立的方案，使用 Sanger测序技术验证导致氨基酸变化的SNP。
[0115] 使用订制Python脚本就品质过滤读数。首先从读数的末端微调低品质碱基，此 后如果如果存在品质>20的至少40个bp和不存在模糊识别的内部碱基，则仅保留它们。 在微调和过滤步骤后，使用 Burrows-Wheeler Aligner(BWA)版本 0.6. I_rl04(http:// bio-bwa. sourceforge. net/)，将读数对一组参比基因组作图。随后使用SAMtools软件包 (http://samtools. sourceforge.net/)，还分析 BWA 的序列 / 图（SAM)输出以识别变体。 随后使用其中变体基于其在基因组内部的位置注释的以R编写的订制脚本，进一步分析所 产生的变体识别。变体还基于覆盖深度过滤、SAMtools报告的基因型品质过滤并针对来自 亲本和突变体的样品而言分离的变体过滤。基于作图结果，SAMtools还用来生成共有序 列。这个序列基于参考序列注释并因Artemis兼容性，使用订制脚本和BioPython (http:// biopython. org/wiki/Biopython)格式化为Genbank文件。亲本基因组与突变体（疫苗） 基因组的比较产生跨两个基因的3个SNP ;1)在rpsL-S12(30S核糖体亚基蛋白）中的两个 SNP和2)在ABC转运蛋白ATP结合膜蛋白中的一个SNP。通过标准Sanger测序方法证实 这三个SNP。
[0116] 30S核糖体亚基蛋白rpsL-S12的功能意义：30S小亚基蛋白（S)和50S大亚基蛋 白（L)是蛋白质合成装置的关键组分。这些亚基蛋白作为许多抗生素的结合位点发挥作用 并且在这些亚基蛋白的任一种/更多种蛋白中的突变导致抗生素耐药性或敏感性。较小亚 基中由单核苷酸多态性（SNP)引起的突变赋予针对以下抗生素的耐药性，如四环素、壮观 霉素、潮霉素B和链霉素，而较大亚基中的突变赋予突变针对氯霉素、红霉素和链霉杀阳菌 素B的耐药性。猪链球菌疫苗株因核糖体小亚单位蛋白（S12)中的这两个SNP而耐受新霉 素（16μg/ml)并且具有无毒力表型。在野生型细菌中，新霉素跨细菌细胞膜主动运输，与 细菌核糖体30S亚基上的特定受体蛋白结合并干扰mRNA(信使RNA)和30S亚基之间的起 始复合物，抑制蛋白质合成。DNA可能错读，因此产生无功能的蛋白质；多核糖体解体并且 不能合成蛋白质[McEvoy，1989]。
[0117]ABC转运蛋白ATP结合膜蛋白的功能意义：细菌ATP结合盒转运蛋白（ABC-转运 蛋白）是细胞存活和传播毒力或毒力相关因子必需的[Davidson等人，2008 ;Henderson等 人，1994] JBC转运蛋白在细胞存活方面极端重要，并且通过介导溶质摄取和防止渗透强度 致死性增加，它们作为渗透保护物质发挥作用[Poolman等人，2004]。另外，细菌的ABC蛋白 质还参与调节几种生理过程。ABC-转运蛋白还通过将下列组分挤出至细胞表面（例如荚膜 多糖、脂多糖和磷壁酸），在细菌外排系统中发挥作用：参与细菌发病机理的蛋白质（例如 溶血，血红素结合蛋白和碱性蛋白酶）、血红素、水解酶、S-层蛋白、感受态因子、毒素、抗生 素、细菌素、肽抗生素、药物和铁载体[Davidson等人，2008 ;Davidson和Chen，2004]。它们 还在生物合成途径（包括胞外多糖生物合成和细胞色素生物生成）中发挥重要作用[Zhou 等人，1998 ;Poole 等人，1994]。
[0118] marR转录调节蛋白的功能意义。NCBI保守结构域（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi ? RID = WWP257H NOlN&mode = all)分析显不，这个基因 编码参与多重抗生素耐药性的含有"螺旋-转角-螺旋"基序的转录调节蛋白（HTH_MARR)， marRAB操纵子的部分。在大肠杆菌中，marA编码抗生素耐药性应答的正调节物，而marR编 码marRAB转录的阻遏蛋白并控制MarA响应于环境信号产生（George和Levy，1983)。在公 开的疫苗株中的SNP位于HTH_MARR结构域（氨基酸位置30至125)内部。螺旋-转角-螺 旋结构域与DNA结合并且是转录调节蛋白的印记特征。野生型MarR蛋白质是每个亚基含 有参与调节转录的翼状螺旋DNA结合基序的二聚体。
[0119] 总之，这三个基因中的突变（汇总于表1中的SNP)使NPL猪链球菌疫苗株无毒力 并且耐受新霉素和可能耐受其他抗生素。
[0120] 表1减毒猪链球菌菌株中SNP的位置和突变基因的鉴定
[0121]
【主权项】
1. 减毒猪链球菌（Streptococcussuis)菌株，能够在猪中针对猪链球菌（S.suis)或 猪链球菌所致的疾病提供安全和有效的免疫反应。
2. 根据权利要求1所述的菌株，在一个或多个毒力基因中相对于其强毒亲本猪链球菌 菌株具有氨基酸置换。
3. 根据权利要求2所述的菌株，其中基因是rpsL-S12 (30S核糖体亚基蛋白）、ABC转 运蛋白ATP结合膜蛋白（ABC-ATPBMP)、marR转录调节蛋白或其组合。
4. 根据权利要求3所述的菌株，其中相对于如SEQIDN0s:2、6、10中所述的序列，在 rpsL-S12中存在至少一种氨基酸置换并且在ABC-ATPBMP中存在至少一种氨基酸置换以及 在marR中存在至少一种氨基酸置换。
5. 根据权利要求4所述的菌株，具有编码如SEQIDN0:4、8、12中所示的氨基酸序列的 核酸序列或其组合。
6. 根据权利要求3所述的菌株，其中相对于表达具有如SEQIDNO:2、6和10中所示 序列的rpsL-S12、ABC-ATPBMP和marR肽的亲本猪链球菌菌株，由rpsL-S12、ABC-ATPBMP、 marR或其组合表达的肽的水平降低。
7. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于它在与ATCC处以专利保藏物名称 PTA-13269保藏的菌株相同的基因中具有突变。
8. 根据权利要求7所述的菌株，其特征在于它是在ATCC处以专利保藏物名称 PTA-13269保藏的菌株。
9. 免疫学组合物，包含根据权利要求1至8中任一项所述的减毒株。
10. 根据权利要求9所述的组合物，还包含可药用或可兽用的媒介物、稀释剂或赋形 剂。
11. 根据权利要求10所述的组合物，还包含佐剂。
12. 根据权利要求11所述的组合物，其中佐剂是壳聚糖。
13. 根据权利要求11所述的组合物，其中佐剂是灭活的细菌、灭活的病毒、灭活细菌的 部分、细菌脂多糖、细菌毒素或其衍生物或组合。
14. 根据权利要求9所述的组合物，在猪中提供针对强毒猪链球菌攻击的保护性免疫 反应。
15. 根据权利要求10至12中任一项所述的组合物，还包含与除猪链球菌之外的病原体 相关的至少一种额外抗原。
16. 根据权利要求15所述的组合物，其中至少一种或更多种额外抗原能够在猪中激发 针对能够在猪中感染并造成疾病或疾病易感性的M.hyo、PCV2、PRRSV、SIV或其他病原体的 免疫反应。
17. 接种动物的方法，包括至少一次施用根据权利要求中任一项所述的10-12、14或16 所述的组合物。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中猪是产仔前约3周至约6周的母猪。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中与来自未接种的母猪的仔猪相比，所得到的仔 猪具有降低的发病率和/或死亡率。
【专利摘要】本发明提供在动物中激发免疫反应的减毒猪链球菌(S.suis)菌株、包含所述菌株的猪链球菌组合物、对抗猪链球菌的接种方法以及采用这类方法和组合物的试剂盒。本发明还提供猪链球菌中致突变方式诱导的新突变，这些突变可用于产生新的减毒猪链球菌细菌菌株。PTA-1326920121017
【IPC分类】A61K39-09
【公开号】CN104780935
【申请号】CN201380040054
【发明人】R·F·贝, P·K·劳伦斯, R·R·西蒙森, K·R·西里吉雷迪, D·A·麦基翁
【申请人】梅里亚有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年6月24日
【公告号】CA2877817A1, EP2866828A1, US20140004144, WO2014004361A1