专利名称：可生物降解的且生物相容的封装有肠炎沙门氏菌的聚合物微球体的制作方法
背景技术：
考虑到每年报道的大量肠炎沙门氏菌病病例，有明显的对用以控制沙门氏菌属肠内病原体在家禽中的传播以及用以防止该病原体传播入它们的卵的可靠的方法的需求。无致病力的和灭活的可注射的肠炎沙门氏菌疫苗已经被开发并且是有效的。但这些接种方法已知因为要求多次接种而导致雏鸡严重紧张。
因此，非常需要这样的方法，通过其可以以简单、单剂量、有效且经济的方式使家禽对肠炎沙门氏菌免疫。
发明概述根据本发明，提供长期释放、生物相容的且可生物降解的、多孔聚合物微胶囊，其包括完整的灭活肠炎沙门氏菌。给药后，肠炎沙门氏菌以两阶段(bipbasic)模式释放，其中在约7至15天的时间内，约20％至约50％的肠炎沙门氏菌以初始速释(initial burst)的方式释放，随后在约70至约100天的时间内，剩余的肠炎沙门氏菌以稳定和持续的方式释放。该微胶囊可以通过水包(油包水)乳化方法制备。
附图的简要说明
图1A和图1B分别显示用PLGA 65∶35和PLGA 50∶50形成的负载有肠炎沙门氏菌的微球体的大小分布和形态学。
图2显示用PLGA 50∶50形成的负载有肠炎沙门氏菌的微球体的大小分布和形态学。
图3A和图3B显示用PLGA 65∶35形成的负载有肠炎沙门氏菌的微球体释放后的大小分布和形态学。
图4显示用PLGA 65∶35形成的负载有肠炎沙门氏菌的微球体释放后的体外释放图(以3mg微球体计算)。
图5显示经用PLGA 65∶35形成的负载有肠炎沙门氏菌的微球体治疗的雏鸡的抗体应答。
发明的详细描述微囊化是将活性物质或者其他合乎需要的物质的非常小的小滴或颗粒均匀地分布在聚合物基质中的方法，该基质是基本上惰性的且用以分隔或者保护该合乎需要的物质。该合乎需要的物质通过腐蚀、渗透或者基质的破裂而从聚合物基质中被释放出来。基质的大小或者材料的变化以及制备该微胶囊的方法的变化可以被用以控制核心物质释放的速率和时间。在下面的描述中，本发明的组合物被描述为微球体。如同在本文中所使用的，该术语包括微胶囊和微颗粒。该术语还包括“亚微”球体，也就是直径在约0.1μm至10μm之间的球。
根据本发明，现在已经发现含有完整的灭活肠炎沙门氏菌的微球体可以被给予家禽以保护家禽免于感染肠炎沙门氏菌。已经发现本发明的疫苗的单剂量在给予后3～4周就给家禽提供保护使其免于感染肠炎沙门氏菌，并且持续至少6个月的时间。
本发明的微球体的特征在于具有两阶段释放模式。具体地说，该微球体在约7至约15天的时间内，优选是约7～10天内提供微球体中总肠炎沙门氏菌的约20％至约50％的高初始释放速率，随后剩余的肠炎沙门氏菌在很长的时间内以更低和稳定的速率释放，如下面所详尽描述的。
用以形成本发明的微球体的优选方法是将所选择的聚合物溶解在一种或几种溶剂中。更具体地说，优选的方法使用称为双乳化方法(也称为复乳化方法)的技术。在双乳化方法中，肠炎沙门氏菌的水溶液被用所选择的聚合物的大量非水溶液乳化。可以通过超声处理或者均化作用制备乳液。优选的溶剂是二氯甲烷。其它合适的溶剂包括乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃和氯仿。水溶液和非水溶液的体积比通常在1∶80至约1∶12的范围内，优选在约1∶40至1∶12的范围内。
溶剂的选择和溶剂的量可以影响所得的微球体的大小和释放图。CH2Cl2或者其它溶剂的量影响聚合物溶液的粘度。使用相对少量的CH2Cl2将提供更粘稠的聚合物溶液，最终导致更大的微球体，并且最终导致更长的肠炎沙门氏菌释放总时间。相对于聚合物的量，增加CH2Cl2的量将导致更多孔的(以及因此的更快释放的)微球体的形成。
合乎需要地，聚合物在溶液中的浓度在约12至约150mg/ml的范围内，优选在约30至约80mg/ml的范围内。如上面所提出的，这暗示如果需要显著改变肠炎沙门氏菌的释放图，则可以改变浓度。同样合乎需要地，肠炎沙门氏菌的水溶液在约20mg/ml至约600mg/ml的范围内，优选在约30至约400mg/ml的范围内。聚合物与肠炎沙门氏菌的重量比影响肠炎沙门氏菌的释放速率。释放速率随改比值降低而略微升高。聚合物重量与肠炎沙门氏菌重量的比在1.5∶1至40∶1的范围内，并且优选在约4∶1至约40∶1的范围内。
所得乳液然后在更大量的水溶液中通过混合(微球体)或者通过超声处理或均化作用(亚微球体)进一步乳化，形成水包(油包水)双乳液。用以形成第二乳液的优选的溶液是磷酸缓冲盐水(PBS)，其另外可以包括乳化剂。合适的乳化剂包括聚乙烯醇(PVA)、斯盘80和吐温80。合适的乳化剂的量通常在约0.01％至约5％(重量)的范围内，对微球体，优选的PVA的量是约0.05％(重量)，对亚微球体，优选的PVA的量是约0.5％(重量)。乳化剂的浓度越高，球大小就越小，其将导致肠炎沙门氏菌的更快的释放图。
改变第一乳液和第二乳液的体积比可以影响溶剂的排除速率。溶剂的排除速率随该比值降低而增加，其导致微球体的表层更密，进一步导致肠炎沙门氏菌的缓慢释放。第一乳液和第二乳液的体积比在约1∶500至约1∶1.5的范围内。优选地，该比值在约1∶50至约1∶1.5的范围内。
然后通过蒸发和/或萃取除去聚合物溶剂，使聚合物硬化并且将含有细菌的内部水滴封装入小微球体中，中数直径通常为约0.1至约400μm，优选为约5至约120μm。当硬化完成后，微球体被过滤(微球体)或者离心(亚微球体)、洗涤并干燥。可以用0.02μm至20μm筛过滤，优选用5μm筛过滤。可以用约15ml至约5000ml水进行洗涤，通常用约100ml至约500ml磷酸缓冲盐水(PBS)。可以用根据常规技术的方法完成干燥，如真空干燥、冷冻干燥和流化床干燥。
合乎需要地，根据本发明制备的微球体每毫克微球体包含约25μg至约400μg肠炎沙门氏菌。通常，给予微球体以使动物得到总剂量至少是0.15mg灭活肠炎沙门氏菌。优选地，给予每只雏鸡的总剂量是约0.15mg至约15mg。
肠炎沙门氏菌的释放可以通过两种不同的机理实现。肠炎沙门氏菌可以通过扩散通过聚合物基质中填充有水的通道而被释放，所述通道是由内部水相产生的空隙或孔，或者在微球体形成期间通过溶剂排除而产生的空隙或孔的结果。微球体的孔隙率导致给予微球体后肠炎沙门氏菌的高初始速释，因为处于或者靠近微球体的孔表面的肠炎沙门氏菌溶解在进入孔中的体液中并从球中被带走。根据本发明，总的封装的肠炎沙门氏菌的约20％至约50％在初始速释中被释放，其通常在约7至约15天的时间内发生。通过实现这种初始释放速率，注射后仅3～4周，被给予微球体的家禽就表现出明显的抗体应答。相比于本领域已知的直到免疫接种后50天才导致明显的抗体应答的免疫接种方法来说，这是有优势的。
释放的第二个机理是由于聚合物降解的肠炎沙门氏菌释放。这在肠炎沙门氏菌初始速释之后，并且导致微球体中剩余的肠炎沙门氏菌更缓和地释放。通常，剩余的肠炎沙门氏菌在至少约10至约15周的时间内被稳定地释放。可以通过改变影响聚合物水合速率的聚合物性质来控制降解速率。这些性质包括，例如，所使用的单体的选择，组成聚合物的不同单体的比，以及聚合物的分子量。这些性质可以影响聚合物的亲水性和结晶性，它们又控制聚合物的水合速率。亲水性的赋形剂，如糖类、表面活性剂、聚乙二醇(PEG)和低分子量聚酯也可以被掺入聚合物中以增加水合作用及改变聚合物的腐蚀速率。
在本发明中有用的聚合物包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物(poly(lactide-co-glycolide)copolymer，PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚原酸酯类、聚酐类和聚磷酸酯类。优选的聚合物是聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物。虽然聚合物可以全部是聚交酯或全部是聚乙醇酸交酯，但优选使用两种聚合物的混合物(PLGA共聚物)，并且该共聚物优选的组成在约65∶35至约50∶50的范围内。合适的聚合物分子量在约10000至约110000的范围内。合乎需要地，对于50∶50的组成，分子量是约40000至约75000，对于65∶35的组成，分子量是约10000至约75000。
通过改变聚合物性质，也就是它的组成、分子量或者它的种类，可以影响释放速率、通过扩散而释放的细菌对通过降解而释放的细菌的比例，以及总的释放时间。例如，改变PLGA的分子量或者聚合物中交酯的含量影响微球体在体液中降解的速率。增加聚(交酯-共-乙醇酸交酯)聚合物中乙醇酸交酯的含量和降低聚合物的分子量可以促进聚合物的水解，因此提供增加的自聚合物腐蚀的肠炎沙门氏菌释放。使用更高分子量的PLGA，例如在约75000至约110000的范围内，或者使用交酯和乙醇酸交酯的比例至少为约75∶25的含量，可以延长在初始速释之后的肠炎沙门氏菌释放时间。但是，合乎需要地使用更大体积的内部水溶液以获得更多孔的微球体，即使用包含相对聚乙醇酸交酯而言高的聚交酯含量，其仍能导致合乎需要的初始释放。同样，可以通过使用两种不同种类的聚合物的组合来调节微球体的降解速率。例如，聚己内酯(PCL)的降解速率比PLGA慢许多；PEG的降解速率快许多。用PEG和PLGA的混合物制备的微球体将具有更快的降解速率和更快的总肠炎沙门氏菌释放速率。PEG对释放的初始速释几乎没有影响；可以通过微球体的孔隙率来控制初始速释中肠炎沙门氏菌的释放。
也可使用聚原酸酯类和聚酐类以两阶段释放模式转运肠炎沙门氏菌，如上面描述的PLGA那样。在本文提供的指导下，本领域技术人员可以设计聚合物基质的组成以具有特定的合乎需要的释放图。
本发明的配方的pH通常在约5至约8的范围内。
除了肠炎沙门氏菌之外，本发明的配方可以包含其它成分，条件是任何这种其它成分均不干扰肠炎沙门氏菌或者其从微球体中的释放，并且提供的量适于安全且有效的给药。这些其它成分可以包括佐剂、营养物、药物、肽和免疫调节剂。有用的佐剂包括氢氧化铝、胶乳粒子或者脂质体，其吸收抗原并增强免疫应答。其它有用的佐剂可以包括皂苷和矿物油。
感兴趣的肽包括胞壁酰二肽(MDP)，其促进抗体产生并刺激和活化巨噬细胞。也可以包括海藻糖二霉菌酸酯用以刺激巨噬细胞。
可以在本发明的组合物中提供的免疫调节剂包括细胞因子，其具有复杂活性以激发巨噬细胞或嗜中性粒细胞的噬菌作用，增加天然杀伤细胞的活性并促进其它细胞因子的产生。另一个有用的免疫调节剂是肿瘤坏死因子(TNF)。某些复合糖类，如酶原、葡聚糖、葡聚糖硫酸酯和凝集素原(lectinan)也能够被包括以用作免疫调节剂并活化巨噬细胞。
为了给予本发明的微球体，可以将适量微球体悬浮在PBS溶液中，并且将所得悬浮液通过注射或者口服给予家禽。合适的剂量包括约0.15mg至约15mg灭活的完整肠炎沙门氏菌。注射液可以通过肌内或者皮下给予。口服给药可以通过滴管进行或者通过将微球体悬浮液混在家禽饲料中进行。
如上所述，已发现包含上述范围内的量的肠炎沙门氏菌的单剂量足以提供至少6个月的保护而免于感染肠炎沙门氏菌。在免疫接种约3～4周内保护有效。
实施例将600mg聚合物PLGA 65∶35溶解在12ml CH2Cl2中。向该溶液中加入0.5ml肠炎沙门氏菌水悬浮液(72mg/ml，内部水相)以通过超声处理制备初级乳液。搅拌下在15℃将所得乳液注射入250ml磷酸缓冲盐水(PBS)中以制备双乳液，所述PBS含有0.05％(重量)聚乙烯醇(PVA)作为乳化剂。然后在4小时内向该溶液中加入640ml含有0.05％(重量)PVA的PBS，用以将CH2Cl2萃取至外相。将所得含有肠炎沙门氏菌的微球体过滤，用PBS洗涤并真空干燥。微球体的大小在适合注射剂的0.5至120μm的范围内。图1A显示微球体的大小分布和形态学。显然所制备的含有肠炎沙门氏菌的微球体具有多孔结构。一旦微球体被给予，多孔结构将允许肠炎沙门氏菌的高初始速释，这将导致高的抗体应答。
2.将5mg依照实施例4制备的负载有肠炎沙门氏菌的微球体悬浮在150μl蒸馏水中，并肌内注射入6只14天大的雏鸡。
3.将9mg依照实施例5制备的负载有肠炎沙门氏菌的微球体通过滴管口服给予6只14天大的雏鸡。
4. 6只14天大的雏鸡的第四组用作对照组并且不接受任何负载有肠炎沙门氏菌的微球体。在上面(1)中使用7天大的雏鸡以研究雏鸡的年龄对免疫接种是否有影响。
给予肠炎沙门氏菌一个月后，用5×107活肠炎沙门氏菌来激发三个治疗组和对照组中的雏鸡的免疫反应。组4中的所有雏鸡都患病，并表现出如明显嗜睡(manifest somnolescence)、虚弱、缺乏食欲以及白垩色白色物质粘附于肛门的临床病征。而所有用肠炎沙门氏菌聚合物微球体治疗的雏鸡都没有出现疾病症状。激发免疫反应的结果列于下表1。从这些结果来看，显然本发明的肠炎沙门氏菌微球体保护雏鸡免于活肠炎沙门氏菌激发免疫反应。
表1用肠炎沙门氏菌微球体治疗后雏鸡的激发免疫反应的结果
权利要求
1.包含封装有肠炎沙门氏菌的聚合物微球体的组合物，其中肠炎沙门氏菌以两阶段模式自微球体中释放，两阶段模式的特征在于，第一阶段中总肠炎沙门氏菌的约20％至约50％在约7至约15天的时间内在初始速释中释放，在所述第一阶段之后的第二阶段中，剩余的肠炎沙门氏菌在约10至约15周的时间内释放。
2.权利要求1的组合物，其中微球体包含聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物(PLGA)、聚原酸酯类、聚酐类、聚磷酸酯类或者它们的组合。
3.权利要求2的组合物，其中微球体包含聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物。
4.权利要求3的组合物，其中交酯与乙醇酸交酯的比在约80∶20至约50∶50的范围内。
5.权利要求4的组合物，其中交酯与乙醇酸交酯的比在约65∶35至约50∶50的范围内。
6.权利要求3的组合物，其中聚(交酯-共-乙醇酸交酯)的分子量在约10000至约110000的范围内。
7.权利要求1的组合物，其中微球体具有约0.1μm至约400μm的直径。
8.权利要求7的组合物，其中微球体具有约5μm至约120μm的直径。
9.权利要求1的组合物，其中微球体另外包含至少一种佐剂、营养物、药物、肽、免疫调节剂或者它们的组合。
10.权利要求1的组合物，其中掺入聚合物中的肠炎沙门氏菌的量是每毫克聚合物约25μg至约400μg。
11.包含遍及分布的肠炎沙门氏菌的聚合物微球体的制备方法，所述方法包括(a)用聚合物的非水溶液乳化肠炎沙门氏菌的水溶液；所述非水溶液具有约12mg/ml至约150mg/ml的重量体积比；其中肠炎沙门氏菌与聚合物的重量比为约1∶40至约1∶1.5，且水介质与非水介质的体积比为约1∶80至约1∶12；(b)将步骤(a)所得的油包水乳液与第二种水溶液混合以形成水包(油包水)双乳液；(c)除去聚合物溶剂以产生多孔微球体；以及(d)将微球体过滤或者离心、洗涤并干燥。
12.权利要求11的方法，其中聚合物包含聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚原酸酯类、聚酐类、聚磷酸酯类或者它们的组合。
13.权利要求11的方法，其中聚合物溶剂包括CH2Cl2、乙酸乙酯、丙酮、四氢呋喃或者氯仿。
14.权利要求11的方法，其中第二种水溶液包含磷酸缓冲盐水或者蒸馏水。
15.权利要求14的方法，其中第二种水溶液另外包含乳化剂。
16.权利要求15的方法，其中乳化剂包括聚乙烯醇、斯盘80或者吐温80。
17.权利要求11的方法，其中微球体具有约0.1μm至约400μm的中数直径。
18.权利要求11的方法，其中微球体包含聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物。
19.权利要求18的方法，其中交酯与乙醇酸交酯的比在约80∶20至约50∶50的范围内。
20.权利要求19的方法，其中交酯与乙醇酸交酯的比在约65∶35至约50∶50的范围内。
21.权利要求18的方法，其中聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物的分子量在约10000至约110000的范围内。
22.权利要求11的方法，其中微球体另外包含至少一种佐剂、营养物、药物、肽、免疫调节剂或者它们的组合。
23.权利要求11的方法，其中掺入聚合物的肠炎沙门氏菌的量是每毫克聚合物约25μg至约400μg。
24.免疫接种家禽使其免于感染肠炎沙门氏菌的方法，所述方法包括给予家禽有效量的权利要求1的微球体。
25.权利要求24的方法，其中微球体以生理学可接受的悬浮液被给予。
26.权利要求25的方法，其中悬浮液通过注射或者口服被给予。
27.权利要求24的方法，其中每只家禽接受的单剂量是约0.15mg至约5mg。
28.权利要求24的方法，其中家禽在给予微球体3～4周后显示有效的肠炎沙门氏菌抗体应答，其持续至少6个月。
29.免疫接种家禽使其免于感染肠炎沙门氏菌的方法，所述方法包括给予家禽单剂量的包含灭活肠炎沙门氏菌的微球体悬浮液，所述灭活肠炎沙门氏菌被封装在包含聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物的多孔聚合物壳体中；所述微球体包含的肠炎沙门氏菌的总剂量为约0.15mg至约15mg；其中给予后肠炎沙门氏菌以两阶段模式自微球体中释放，其中约20％至约50％的被封装的肠炎沙门氏菌在给予悬浮液的7至约15天在第一阶段中在初始速释中释放，剩余的肠炎沙门氏菌在约10至约15周的时间内在第二阶段中释放。
30.权利要求29的方法，其中在给予微球体的约3～4周内免疫接种有效。
全文摘要
将可生物降解的且生物相容的封装有肠炎沙门氏菌的聚合物微球体给予雏鸡以给雏鸡提供持久的保护使其免于感染肠炎沙门氏菌。
文档编号A61P31/04GK1346276SQ00806041
公开日2002年4月24日 申请日期2000年2月8日 优先权日2000年2月8日
发明者杨义燕, 吉米·况, 陈雪琴, 钟台生, 刘伟 申请人:分子农业生物学院