专利名称：抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的重链及轻链可变区基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗鳗弧菌独特型单克隆抗体IE10的重链及轻链可变区基因以及由所述基因编码的多肽。
背景技术：
鳗弧菌(Vibrio.anguillarum)是一种危害海水鱼及淡水鱼的重要病原体，可通过受损伤的皮肤及口而轻易感染，对其敏感的鱼类有虹鳟、鳗、香鱼、石斑鱼等几十种，在我国十分流行，死亡率非常高。传统防治多使用抗生素及减活、灭活疫苗。抗生素的长期使用易使鱼体产生耐受；减活疫苗安全性难以掌握；灭活疫苗由于使用物理、化学方法灭活，抗原活性有可能受到破坏并且残存的杂质还会引起鱼体出现炎症甚至死亡。鱼类养殖业的发展与疾病的防治息息相关，近年来，随着分子免疫学与基因工程技术的迅猛发展，国外已有新一代基因工程疫苗开始涌现，如DNA疫苗、抗独特型抗体疫苗、合成肽疫苗(表位疫苗)及基因工程减毒活疫苗等。这些新型疫苗在安全性、高效性、廉价性等方面各有优势也各有缺陷，由于种种原因目前基本上还停留在实验室阶段而未能大量用于养殖渔业(Leong TC，Anderson E，etal.Dev.Biol.stand，1997，90267-277)。并且已有研究基本上集中在病毒性疫苗，如VHSV病毒，IHNV病毒等，细菌性疫苗的研究非常有限。我国在鱼用基因工程疫苗尤其是针对海鱼病原体的基因工程疫苗研究方面基本属于空白。
抗独特型抗体能够模拟抗原表位，可作为疫苗侯选，但依靠杂交瘤细胞大量生产抗体成本较高(Bona CA et al.Nat.Med.1998，4(6)668-669)，这一问题可通过基因工程抗体技术得到解决。已知免疫球蛋白(Ig)是一种多功能区域蛋白，其中Fv抗体是保留完整抗原结合位点的最小抗体片段，具有分子量小，易穿透组织，不使机体产生免疫排斥反应等优点。因此，近年来利用基因工程抗体技术构建Fv抗体已成为研究热点之一。Fv由重链(VH)和轻链(VL)组成，天然Fv片段中的VH和VL为非共价键结合，在低浓度下极易解高而失去结合活性。DNA重组技术的发展使得体外表达Fv成为可能，主要包括单链抗体(ScFv)和二硫键稳定性抗体(dsFv)的研究。ScFv是通过由15个氨基酸组成的连接肽将VH和VL连接起来的单链抗体(Tripathi PK，et al.Mol Immunol.1998 Sep；35(13)853-63)。dsFv是将克隆化VH和VL基因的H44/L100或H105/L43位置突变为半胱氨酸，用链间二硫键代替肽接头，使VH和VL形成稳定的异聚体(dsFv)，通过相应载体系统的构建，可表达在噬菌体表面，并且该dsFv性质稳定，与抗原的结合不受影响，有时还会表现更好的结合活性，较ScFv更有应用前景(Ulrich Brinkman，et al.Journal of Immunological methods 1995，18241-50)。
抗鳗弧菌独特型单克隆抗体疫苗是第四军医大学基础部组织学与胚胎学教研室多年以来的研究成果，国内外均未见类似报告。自1997年以来，本教研室一直从事海鱼细菌性疾病疫苗的研制工作。先后成功制备了抗鳗弧菌单克隆抗体(夏永娟、黄威权、李元等，抗鳗弧菌单克隆抗体的研制及鉴定；细胞与分子免疫学杂志，200016(1)81)及抗鳗弧菌独特型单克隆抗体(Xia Yongjuan，Huang Weiquan et al.Fish & Shellfish Immunology，2002，12，273-281)。我们筛选出的抗独特型抗体1E10具有特异性并且通过大量的海鱼保护实验证实它能够发挥疫苗的作用，能够预防鳗弧菌感染。但是，抗独特型抗体疫苗必须通过大量培养杂交瘤细胞获得，作为鱼用疫苗成本较高。
发明内容
本发明的目的是从分泌抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E10中克隆出保留完整抗原结合位点的重链和轻链可变区基因并由此推测由所述基因编码的多肽。
本发明利用基因工程抗体技术从分泌抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E10中成功克隆出了抗体的重链和轻链可变区基因。抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的重链可变区基因(VH)，其具有序列表<400>1的序列。由抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的重链可变区基因编码的多肽，其具有序列表<400>2的序列。抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的轻链可变区基因(VL)，其具有序列表<400>3的序列。由抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的轻链可变区基因编码的多肽，其具有序列表<400>4的序列。其中VH长度为368bp，编码122个氨基酸；VL长度为339bp，编码113个氨基酸。VH和VL基因均具有小鼠IgG可变区基因的特征含有3个抗原互补决定区(CDR区)，基因内不存在终止码，并具有抗体特征性的两个半胱氨酸。这两个基因通过文献检索及与Genebank内的序列比较，均未见相同序列。本发明所获基因可用于制备预防海鱼鳗弧菌感染的基因工程疫苗，基因工程疫苗只需繁殖大肠杆菌即可获得，疫苗的成本会大幅度降低，利于工业化生产，将会对我国养殖渔业带来可观的经济收入。该项研究国内外均未见报道。
图1示出抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的重链可变区基因PCR后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图2示出抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的轻链可变区基因PCR后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3重链可变区基因的DNA测序图。
图4轻链可变区基因的DNA测序图。
具体实施例方式
以下参照附图及实施例详细描述本发明。
实施例抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的重链可变区及轻链可变区基因的克隆应用RT-PCR技术从抗鳗弧菌独特型单克隆杂交瘤细胞株1E10(Xiayongjuan et al，Fish & Shellfish Immunology，2002，12，273-281)中克隆抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的重链可变区基因及轻链可变区基因。具体操作如下1)总RNA提取按TRIZOLTMReagents(购于Life Technologies公司)试剂盒说明书进行。用50ml的细胞培养瓶将抗鳗弧菌独特型单克隆杂交瘤细胞株1E10培养到对数生长期，细胞密度2×107个/ml；向细胞培养瓶中加入2.8ml TRLZOL液，用吸管吹吸几次；移入5ml离心管，置15-30℃，5分钟，加入0.56ml氯仿，盖紧离心管，摇晃15秒后置15-30℃，3分钟。4℃，12000g离心15分钟；将上层水相移入新的离心管，加入1.4ml异丙醇，在15-30℃放置10分钟后，12000g离心15分钟；去掉上清液，加入3ml 75％乙醇洗一次(涡旋并在4℃，7500g离心5分钟)；将RNA在空气中干燥10分钟，加入无RNA酶的水，用枪吹吸几次。
2)逆转录反转录试剂盒为Invitrogen公司产品。取2μg总RNA置于0.5ml Eppendorf管中，加入随机引物Oligo(dT)181μl，于70℃水浴10分钟，冰上5分钟。然后依次加入5×reaction buffer 4μl，Ribonucleaseinhibitor 1μl，10mM dNTP mix 2μl，于37℃水浴5分钟。加M-MLV反转录酶1μl，于42℃水浴2小时。最后于70℃水浴10分钟。
3)PCR扩增抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的重链可变区基因重链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl)10×PCR缓冲液5μl25mM Mgcl23μl10mM dNTP1μl3’端引物1μl5’端引物1μlTaq DNA聚合酶0.5μlcDNA 2μl水 36.5μl引物为简并引物，其中VHback5-AGGTCCARCTKCTCGAGTCWG-3；VHfor5-GAC HCATGG GGS TGT YGT GCT AGC TGM RGA GAC DGT GA-3K＝G or T，W＝T or A，H＝A，C or T，S＝C or G，Y＝T or C，M＝A or C，R＝A or G，D＝A，G or T)反应条件94℃3分钟94℃30秒55℃30秒72℃30秒72℃7分钟25个循环4)PCR扩增抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的轻链可变区基因
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl)10×PCR缓冲液5μl25mM Mgcl23μl2.5mM dNTP 4μl3’端引物1μl5’端引物1μlTaq DNA聚合酶0.5μlcDNA 2μl水 33.5μl引物为简并引物，VLback5’-ACG TTT CAG CTC CAG CTT GG-3’；VLfor5-GAT RTT KTG ATG ACC CAR AC-3’(K＝G or T，W＝T or A，H＝A，C or T，S＝C or G，Y＝T or C，M＝A or C，R＝A or G，D＝A，G or T)反应条件94℃4分钟94℃1分钟58℃1分钟72℃1分钟72℃5分钟25个循环5)PCR产物的鉴定PCR产物经1％的琼脂糖胶电泳鉴定后切胶回收，如图1、图2所示电泳结果，抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的重链可变区基因所获片段大小在300bp-500bp之间，抗鳗弧菌独特型单克隆抗体1E10的轻链可变区基因所获片段大小在300bp-500bp之间。将回收获得的基因片段与T载体连接，转化Ecoli.DH5α感受态细胞，在含100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选转化菌。挑取单个菌落扩大培养后，用碱裂解法小量提取质粒，并以PCR法鉴定。采用双脱氧终止法进行序列测定，测序引物采用T载体上的固有序列M13-47Primer。经测序VH长度为368bp，编码122个氨基酸；VL长度为339bp，编码113个氨基酸。VH和VL基因均具有小鼠IgG可变区基因的特征含有3个抗原互补决定区(CDR区)，基因内不存在终止码，并具有抗体特征性的两个半胱氨酸。
权利要求
1.一种抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的重链可变区基因(VH)，其具有序列表<400>1的序列。
2.由抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的重链可变区基因编码的多肽，其具有序列表<400>2的序列。
3.一种抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的轻链可变区基因(VL)，其具有序列表<400>3的序列。
4.由抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的轻链可变区基因编码的多肽，其具有序列表<400>4的序列。
全文摘要
本发明利用基因工程抗体技术从分泌抗鳗弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E10中成功克隆出了抗体的重链和轻链可变区基因以及由所述基因编码的多肽。这两个基因通过文献检索及与Genebank内的序列比较，均未见相同序列。本发明所获基因可用于制备预防海鱼鳗弧菌感染的基因工程疫苗，基因工程疫苗只需繁殖大肠杆菌即可获得，疫苗的成本会大幅度降低，利于工业化生产，将会对我国养殖渔业带来可观的经济收入。该项研究国内外均未见报道。
文档编号C07H21/04GK1590400SQ200310105849
公开日2005年3月9日 申请日期2003年10月23日 优先权日2003年10月23日
发明者夏永娟, 黄威权, 黄宝成 申请人:中国人民解放军第四军医大学