专利名称：细菌感染的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗艰难梭菌(Clostridium difficile)感染的化合物、药物和治疗剂，以及新的分离的抗体和它们在治疗艰难梭菌感染中的用途。本发明还涉及预防和治疗屎链球菌(E.faecium)和粪链球菌(E.faecalis)感染，并提供用于预防和治疗屎链球菌和粪链球菌感染的药物和治疗剂。
艰难梭菌(C. difficile)为革兰氏阳性厌氧菌，并被认为是引起从轻度腹泻至爆发性假膜性结肠炎(PMC)(合称为艰难梭菌抗生素相关性腹泻(CDAD))的疾病谱的重要的人类病原体。CDAD是常见的、医源性、医院内感染疾病，具有一定发病率和死亡率，尤其是在老年人中。在CDAD的发病机理中，有两个因素起主要作用，即施用抗生素对固有的肠道菌群的抑制和由细菌生成了两种高分子量的毒素细菌(外毒素A和外毒素B)。
细菌在医院很普遍，研究已经表明在住院时，在重症监护病房接受抗生素治疗的患者中约三分之一受到艰难梭菌感染(Kyne，L.，etal.，2002，Clin.Infect.Dis.34(3)，pp346-53，PMID11774082)。在这些患者中，超过半数会发展成CDAD，其余的为无症状携带者。CDAD是患者住院时间延长的主要因素，有估计表明，在美国，该疾病每年的花费超过11亿美元(Kyne，L.，et al.，Supra)。患有CDAD的患者对包括停药刺激性抗生素的治疗和抗生素甲硝唑和万古霉素的治疗有良好的应答。对最初的抗生素治疗的应答率可以很高(达95％)，但是达20％的患者在初次治疗的一至两周内复发，随着每次复发使复发的风险不断增加。典型地，可用抗生素治疗复发，这表明复发是由不同的艰难梭菌菌株感染所致。此外，有证据表明艰难梭菌正变得对甲硝唑有耐药性，并且对万古霉素有部分耐药性，这证实在CDAD的治疗中需要新的选择。
由细菌致病菌株生成的外毒素A和B具有细胞毒性、肠毒性和促炎性，并被认为是该非侵入性微生物的主要致病因子。然而，并非所有的产毒菌株感染都会导致疾病，这提示应研究其它的致病因子。细菌表面表达抗原代表候选致病因子，并且也被认为非常重要，因为这种蛋白质可能介导重要功能(例如在建群的第一步中粘附至肠道上皮层或与局部免疫介质相互作用)。与许多其它细菌一样，艰难梭菌在细胞外表面表达结晶或类结晶表层(S-层)。这种S-层包含在细菌外表面上形成规则排列晶格的蛋白质或糖蛋白，且在先前已被表明对病原体例如杀鲑变形菌(Aeromanas salmonicida)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fatus)的毒性是必需的。与大多数包含一个S-层的细菌相反，已知艰难梭菌包含两个重叠的类结晶S-层，每一S-层由糖蛋元亚单位构成，所述亚单位的表观分子量在不同的艰难梭菌菌株中有轻微改变。大多数艰难梭菌菌株表达两个主要的S-层蛋白质(SLP)，一个为32-38kDa(低分子量SLP)，另一个为42-48kDa(高分子量SLP)。该低分子量SLP显示呈免疫显性，是CDAD患者可识别的最普遍的抗原，并且是在对兔抗整个艰难梭菌细胞中出现的抗血清所识别的细菌EDTA提取物中的唯一抗原(Calabi，E.et al.，2001，Mol.Microbiol.，40(5)p1187-99，PMID11401722)。
在微生物感染过程中，免疫系统应用了多种适应性策略。其中一种可以说是最重要的策略是产生抗体应答。制备能结合由感染原所展示的抗原的抗体，并将其与微生物结合以通过补体激活、巨噬细胞的募集和通过与微生物本身直接相互作用而杀死微生物。能结合给定抗原的抗体的治疗效力是变化的，这体现在免疫系统产生的抗体在感染过程中成熟并变得能够集中于使患者成功抗击感染的事实。
B细胞储备库引发抗体应答，其中每个B细胞各自生成结构不同的抗体分子。该B细胞/抗体储备库的实际大小是未知的，但据估计，在培养的B细胞中，对给定抗原的反应性的随机克隆频率可高达1/100,000(Nobrega，A.，et al.，Eur J Immunol.1998 Apr；28(4)1204-15；PMID9565360)。在感染过程中，选择能结合病原体的抗体，以通过B细胞群的变化而使得关键抗体能大量产生。这些变化的机制包括克隆性增殖、同种型转换和免疫球蛋白可变区的体细胞突变。负责产生能够结合抗原的抗体的B细胞增殖，因而，改变B细胞储备库并改变B细胞的比例。
在小鼠模型中，发现抗艰难梭菌外毒素A的细胞结合结构域的抗体受到保护，并且发现有艰难梭菌建群但没有症状的患者具有提高的抗-外毒素AIgG滴度。显示出这种提高的血清抗-外毒素AIgG滴度以应答建群的被感染患者患上CDAD的可能性较那些不显示出这种提高的滴度的患者少48倍。因此，如使用抗-艰难梭菌外毒素A抗体一样，用艰难梭菌外毒素A接种疫苗也被认为是一种治疗策略(Giannasca PJ and Warny M.，Vaccine，2004Feb 17；22(7)848-56；PMID15040937)。
用于治疗/预防艰难梭菌感染的基于非抗生素的治疗方案是基于接种疫苗和被动免疫。接种疫苗治疗包括给患者施用编码艰难梭菌表层蛋白或其变体或类似物的免疫原性片段的核酸序列或等价多肽片段(如在WO 02/062379中公开的)。典型地，被动免疫疗法通过给患者施用特异于病原体产生的免疫原的单克隆抗体实现。一般而言，被动免疫疗法对于治疗不能对接种疫苗产生应答的无免疫应答患者，和急需治疗且不能等待接种疫苗见效的患者特别有效。在艰难梭菌感染的情况下，被动免疫依靠给患者施用毒素中和多克隆免疫球蛋白(如在WO 99/20304中公开的)，或产生的抗全部细菌和毒素的抗体(如在WO 96/07430中公开的)。
因此，艰难梭菌感染的有效治疗非常重要，现有技术教导这种治疗的目标应为抗艰难梭菌外毒素A、抗所述表层蛋白的接种疫苗或被动免疫疗法，或为特异性抗未鉴定的细菌毒素的多克隆血清。
然而，本申请发明人已经鉴定了用于治疗的特异性靶点。下面的实验表明艰难梭菌感染患者产生了特异性抗乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)的抗体提高的滴度，且抗-乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)抗体本身在治疗艰难梭菌感染中是有用且有效的。此外，当抗-乙酰辅酶A乙酰转移酶抗体，尤其是从来自艰难梭菌感染患者的最主要的CDR序列构建的合成抗体，与抗生素万古霉素或庆大霉素一起使用时，会产生对艰难梭菌感染的协同治疗。
因此，本发明的第一方面提供了乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂在制备用于治疗或预防艰难梭菌感染的药物中的用途。
除非另有明确说明，本申请所使用的术语“治疗”具有广泛的含义。因此，通过“治疗”意指在治愈、缓解、消除或减轻人类或动物体感染性疾病或机能障碍的症状，或预防或减少这种可能性。因此，术语“治疗”意指疾病的治疗及它们的预防。
特别地，乙酰辅酶A乙酰转移酶可来自艰难梭菌，且其可具有SEQ ID NO43的序列。
大量的抑制剂可用于特异性抗乙酰辅酶A乙酰转移酶。特别地，乙酰辅酶A乙酰转移酶可以与抑制剂形成特异性结合对(specificbinding pair，sbp)，乙酰辅酶A乙酰转移酶为该对的第一个成员，抑制剂为第二个成员。
在本申请中，“特异性结合对的成员”是两个不同分子中的一个，所述分子在表面上或空腔中具有与另一分子特异性结合从而被定义为与另一分子的特定空间或极性结构互补的区域。所述特异性结合对的成员被称作配体和受体(反配体(antiligand))、sbp成员和sbp配偶体、sbp成员等。这些通常是免疫学配对的成员例如抗原-抗体，尽管该术语没有更广泛地包括其它特异性结合对例如RNA-蛋白、DNA蛋白等。
因此，所述抑制剂可以是抗体或其抗原结合片段，且其可以特异性地抗由SEQ ID NO47的肽所展示的表位。
如在下面实验部分详述的那样，由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位已被鉴定为在各种抗原中是保守的，并因此被鉴定为展示由那些抗原所共享的保守表位的肽.
本申请所使用的各种语法形式的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部位，即含有抗体结合位点或抗原互补位的分子。这样的分子也被称为免疫球蛋白分子的“抗原结合片段”。
示例性抗体分子有完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和含有抗原互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域中已知的那些部分如Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv和F(v)。抗体及其制备和用途是本领域所众所周知的(例如Harlow，E.and Lane，D.，″Using AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1998)。
如在下面的实验中所详述的那样，已经克隆了艰难梭菌感染患者所产生的抗体的可变重链(VH)和可变轻链(VL)，对其进行测序并鉴定它们的互补决定区(CDR)。结果已显示存在高免疫原性VH链CDR1-3(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，和高免疫原性VL链CDR1-3(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。
因此，所述抗体或其抗原结合片段可具有VH链互补决定区(CDR)1-3，其分别具有SEQ ID NO2-4的序列。特别地，所述抗体或其抗原结合片段可具有VH链，该VH链具有SEQ ID NO1的序列。
类似地，所述抗体或其抗原结合片段可具有VL链互补决定区(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。特别地，所述抗体或其抗原结合片段可具有VL链，VL链具有SEQ ID NO16的序列。
已制备和使用了具有上述序列的合成抗体，因此，所述抗体可具有SEQ ID NO41的序列。下面详述的具有SEQ ID NO41的抗体也包含N-末端S-标记和C-末端His-标记。所述标记可用于实验目的，但对于治疗性抗体是非必需的，尽管它们(或其它标记)可能被认为是有用的。因此，所述抗体可以额外地包含His-标记，例如C-末端His-标记。
下面的实验也表明不仅乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂本身可有效地实现治疗艰难梭菌感染，而且，当其与现有的抗生素特别是庆大霉素和万古霉素联合使用时也是有效的，这种应用可提供协同作用。初步的实验结果也表明使用甲硝唑也实现了协同。
因此，所述药物可以额外地包含至少一种选自以下一组的抗生素庆大霉素、万古霉素和甲硝唑。
自然地，本发明的医药制剂可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences和US Pharmacopoeia，1984，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA；United StatesPharmacopoeia，ISBN1889788031)。
如上述，乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂本身可有效地实现治疗艰难梭菌感染。因此，本发明也提供了包含至少以下之一的分离的和/或纯化的抗体(i)VH链互补决定区(CDR)1-3，其分别具有SEQ ID NO2-4的序列；和(ii)VL链互补决定区(CDR)1-3，具有SEQ ID NO17-19的序列。
如上述，所述VH链可以具有SEQ ID NO1的序列。所述VL链可以具有SEQ ID NO16的序列。所述抗体可以具有SEQ ID NO41的序列。
本发明还提供了编码这种抗体的核酸分子。所述核酸分子可以是分离的和/或纯化的。特别地，所述核酸分子可具有SEQ ID NO46的序列。
本发明还提供了乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂和万古霉素在制备用于预防或治疗屎链球菌或粪链球菌感染，尤其是万古霉素耐药性屎链球菌感染的药物中的用途。
下述实验不仅表明使用乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂和万古霉素可产生艰难梭菌感染的协同治疗，而且也产生屎链球菌感染尤其是万古霉素耐药性屎链球菌感染的协同治疗。初步的实验也已表明在粪链球菌感染的治疗中也观察到了协同作用。
所述乙酰辅酶A乙酰转移酶可以来自艰难梭菌。
所述抑制剂可以是抗体或其抗原结合片段，且其可特异性地抗由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位。
根据本发明的其它方面，所述抗体或其抗原结合片段可具有VH链互补决定区(CDR)1-3，其分别具有SEQ ID NO2-4的序列。所述抗体或其抗原结合片段可具有VH链，该VH链具有SEQ ID NO1的序列。
所述抗体或其抗原结合片段可具有VL链互补决定区(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。所述抗体或其抗原结合片段可具有VL链，该VL链具有SEQ ID NO16的序列。
所述抗体或其抗原结合片段可具有SEQ ID NO41的序列。
当本发明涉及提供含有两种或多种活性成分(例如抗体和抗生素)时，本发明还提供了包含这种活性成分的组合制剂。例如，可提供两种组分分别包装(two-pack)的制剂。
因此，本发明还提供了用于治疗艰难梭菌感染的组合制剂，其包含(i)乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂；和(ii)至少一种选自庆大霉素、万古霉素和甲硝唑的抗生素。
本发明还提供了用于治疗屎链球菌或粪链球菌感染的组合制剂，其包含(i)乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂；和(ii)万古霉素。
所述屎链球菌或粪链球菌可以是对万古霉素耐药性的。
本发明也涉及治疗患者的方法。因此，本发明还提供了治疗艰难梭菌感染的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂。该方法还可包括施用治疗有效量的至少一种选自庆大霉素、万古霉素和甲硝唑的抗生素。
本发明还提供了治疗治疗屎链球菌或粪链球菌感染的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的(i)乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂；和(ii)万古霉素。
所述屎链球菌可以具有万古霉素耐药性。
根据以下描述，本发明将变得更加显而易见，以下描述仅通过实施例的形式显示了治疗艰难梭菌和屎链球菌感染的形式。
试验在以下的实验中，已用来自艰难梭菌感染患者的最主要的VH和VL抗体序列构建了合成抗体。利用这一合成抗体，分离并纯化抗原，并利用电喷射质谱鉴定所分离蛋白质的推定的部分序列。搜索匹配的艰难梭菌基因组序列鉴定到可能的候选匹配序列。对候选艰难梭菌序列的比较鉴定到被分类为乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)大量同源蛋白质，并证实其为该家族的成员。最匹配的序列是来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的NP_349376，其在391个氨基酸的长度上显示出68％的同源性。候选蛋白质的克隆、表达和纯化得到了所述合成抗体强结合的蛋白质。进一步试验已表明特异性抗艰难梭菌乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)的抗体与万古霉素和庆大霉素在艰难梭菌感染的治疗中显示出协同作用。初步试验也表明使用甲硝唑也会产生协同。
实验同样显示出所述合成抗体和万古霉素之间在万古霉素耐药性屎链球菌的治疗中的协同。初步试验(未显示)还显示出所述合成抗体和万古霉素之间在治疗粪链球菌感染中的协同。
除非另有说明，利用可适用的标准方法和以下厂商的使用说明进行所有程序。用于各项技术的标准方法包括PCR、分子克隆、操纵和测序、抗体的制备、表位作图和模拟表位(mimotope)设计、细胞培养和噬菌体展示，公开于文献例如McPherson，M.J.et al.(1991，PCRA practical approach，Oxford University Press，Oxford)、Sambrook，J.etal.(1989，Molecular cloninga laboratory manual，Cold Spring HarbourLaboratory，New York)、Huynh and Davies(1985，″DNA Cloning Vol I-APractical Approach″，IRL Press，Oxford，Ed.D.M.Glover)、Sanger，F.etal.(1977，PNAS USA 74(12)5463-5467)、Harlow，E.and Lane，D.(″Using AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，1998)、Jung，G. and Beck-Sickinger，A.G.(1992，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，31367-486)、Harris，M.A.and Rae，I.F.(″General Techniques of Cell Culture″，1997，Cambridge UniversityPress，ISBN 0521 573645)、″Phage Display of Peptides and ProteinsALaboratory Manual″(Eds. Kay，B.K.，Winter，J.，and McCafferty，J.，Academic Press Inc.，1996，ISBN 0-12-402380-0)中。
在本申请中详述的方法或其它方法中有用的试剂和装置可获自例如Amersham(www.amersham.co.uk)、Boehringer Mannheim(www.boehringer-ingeltheim.com)、Clontech(www.clontech.com)、Genosys(www.genosys.com)、Millipore(www.millipore.com)、Novagen(www.novagen.com)、Perkin Elmer(www.perkinelmer.com)、Pharmacia(www.pharmacia.com)、Promega(www.promega.com)、Qiagen(www.qiagen.com)、Sigma(www.sigma-aldrich.com)和Stratagene(www.stratagene.com)。
本申请中所讨论的各参考文献的内容，包括其中引用的参考文献，通过引用以其整体合并入本申请中。
给出的出版物“PMID”参考文献号为美国国家医学书馆(US National Library of Medicine)分配的PubMed标识号，在www.ncbi.nlm.nih.gov上可获得每篇出版物的完整著录信息和摘要。这也能提供完整的出版物电子版的直接入口，尤其是例如PNAS、JBC和MBC的出版物。
使用如在National Center for Biotechnology Information，USA(www.ncbi.nlm.nih.gov)上的具有默认参数的BLAST2程序(TatusovaTA et al.，FEMS Microbiol Lett.1999 May 15；174(2)247-50；PMID10339815)确定序列同源性。
鉴定来自艰难梭菌感染患者的主要VH和VL抗体序列为了鉴定来自艰难梭菌感染患者的抗体序列并确定主要抗体序列，特别是CDR序列，使用了WO 03/052416中所详述的方法。利用以下基本步骤鉴定产生抗体的B细胞，对其进行测序和分析(参见WO 03/052416)(1)从人类患者的循环B细胞中分离VH和/或VL编码区域；(2)确定VH和/或VL储备库的核苷酸序列；(3)确定VH和/或VL初级氨基酸序列；(4)在硅片上提取CDR区域-加入到数据库中；(5)测定VH和/或VL储备库中主要CDR和框架区；(6)自主要抗体序列构建和生产治疗性重组体抗体。
对来自四名感染患者(D01、D02、D03和D04)的抗体片段进行测序。
重链(CDH1)CDH1是来自艰难梭菌感染患者的最常见的VH链。其已通过分析来自患者抗体VH链的CDR3序列得到证实。来自艰难梭菌感染患者的226/1011(22.4％)的克隆抗体具有相同的CDR3序列(以下称CDR-H3)。发现CDH1存在于四分之三的患者中。其CDR3序列在来自患者D01的184/318(57.9％)的克隆中出现；在D03中，其在40/291(13.7％)的克隆中出现；在D04中，其在2/252(0.8％)的克隆中出现。最常见的完整VH序列为SEQ ID NO1。
在该VH链序列中，CDR(互补决定区)序列如下CDR-H1SEQ ID NO2CDR-H2SEQ ID NO3CDR-H3SEQ ID NO4同源性搜索已鉴定到与所述CDR-H3序列(SEQ ID NO4)具有高于70％的同源性的其它几条CDR3序列，这些序列都来自艰难梭菌患者。所述CDR3序列为SEQ ID NO5-15。
轻链(CDL1)H1L1的轻链衍生自具有来自艰难梭菌感染患者的最常见的CDR3序列的克隆。CDL1在患者D01中以84/251(33.5％)的频率存在。最常见的含有这一CDR3序列的VL序列为SEQ ID NO16。
在该VL链序列中，CDR(互补决定区)序列如下CDR-L1SEQ ID NO17CDR-L2SEQ ID NO18CDR-L3SEQ ID NO19同源性搜索已鉴定到与CDR-L3序列具有高于70％的同源性其它几条CDR3序列，这些序列都来自艰难梭菌患者。所述CDR3序列为SEQ ID NO20-40。
抗体H1L1的构建和克隆按照如下构建合成抗体H1L1分别从测序载体PCR扩增CDH1和CDL1，并克隆到克隆载体pGEM-T easy(Promega Corporation)中以便于DNA测序。根据厂商的使用说明，使用QIAquick PCR纯化离心柱(Qiagen，UK)制备3μg PCR产物用于限制性酶切。将DNA从旋转柱上洗脱到40μL的EB缓冲液中。将纯化的PCR产物(2μL)与1μL pGEM-T easy载体、6μL水和1μLDNA连接酶混合，将混合物于室温连接1小时。然后，通过电穿孔将连接物转化到电感受态E.coli TGl细胞中(Stratagene)，并涂于含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(100μM)和X-gal(0.006％w/v)的琼脂平皿上。允许菌落于37℃生长过夜，然后贮存于4℃。在该培养基上，重组菌落被鉴定为白色菌落。
这得出具如下通式结构的抗体S-标记-CDH1-接头-CDL1-His-标记其具有SEQ ID NO41的氨基酸序列，含有N-末端S-标记和C-末端His-标记。
抗体H1L1-乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)的靶点的鉴定材料和方法样品制备将在血液琼脂平皿上生长的艰难梭菌细胞(NCTC 11204)悬浮于10mM的PBS(磷酸盐缓冲液)中，在冰上超声处理5×1分钟。以13000rpm离心细胞裂解液5分钟，并将300μl上清液在于冷丙酮中的20mL 10％的三氯乙酸和20mM DTT(二硫苏糖醇)中沉淀45分钟。通过离心回收蛋白质，用含有20mM DTT的冷丙酮洗涤沉淀三遍。
2D-凝胶电泳将蛋白质沉淀溶于样品再水合溶液(7M尿素、2M硫脲、3％(w/v)CHAPS、0.002％溴酚蓝水溶液)中，并用相同的溶液进行稀释用于等电聚焦。使用Zoom IPGRunner(RTM)系统(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)在3-10(7em)的非线性pH范围内进行等电聚焦共1700Vh，每一条带装载约15μg蛋白质。在进行第二向分离前，在含有5mM DTT的平衡缓冲液中(50mM Tris-HCl pH8.8，6M尿素、30％甘油、2％(w/v)SDS、0.002％溴酚蓝的水溶液)平衡每一条带15分钟，然后在含有125mM碘代乙酰胺的相同缓冲液中再平衡15分钟。
使用NuPage 4-12％Bis-TrisZoom凝胶和MOPS缓冲液(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)进行第二向分离。将蛋白质转印至Invitrolon PVDF膜(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)上，并在10mM PBS(含5％脱脂乳、0.1％Tween20)中封闭1小时。
免疫印迹为了鉴定抗体H1L1的靶点，在含5％脱脂乳及0.1％Tween20的10mM PBS中用纯化的H1L1抗体温育所述膜1小时。洗涤后，使用与辣根过氧化物酶(Santa Cruz Biotechnologies)结合的抗-His抗体，用0.1％Tween20以1∶500的比例稀释于10mM PBS中，检测结合的H1L1。用含0.1％Tween20的10mM PBS溶液洗涤后，应用ECL(Amersham biosciences，Little Chalfont，UK)使印迹显影。
为了在艰难梭菌感染患者中显现IgG抗体的靶点，用以0.1％Tween20按1∶20-1∶50稀释于10mM PBS中的血清温育膜1小时。当使用SigmaFast(RTM)5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑片(Sigma)显影时，使用与辣根过氧化物酶(用于ECL)或碱性磷酸酶(Sigma)结合的抗IgG-抗体。
电喷射质谱将从凝胶上切下的蛋白质条带或蛋白质斑点在25mM碳酸氢铵中洗涤10分钟，并用25mM碳酸氢铵乙腈1∶2脱水15分钟。重复碳酸氢铵洗涤和脱水步骤，在SpeedVac(RTM)中干燥凝胶片。加入少量体积的胰岛素(10μg/ml，于25mM碳酸氢铵中)直到凝胶片恢复至它们的最初大小，加入少量25mM碳酸氢铵以使凝胶片在消化期间保持湿润。于37℃消化样品4.5小时，通过添加80μl乙腈萃取肽15分钟。在SpeedVac中干燥上清液直至蒸发掉所有的乙腈。用C-18 Zip-Tips(Millipore)对样品脱盐，并利用纳喷雾飞行时间质谱(Q-TOF，Micromass，Manchester，UK)对样品进行分析。
结果使用2D凝胶和免疫印迹分离抗体H1L1的靶点将2D凝胶和免疫印迹相结合用以精确定位2D凝胶上的抗原。比较两个印迹，一个使用来自患者的血清，其最丰富的抗体是用于H1L1的模版；一个使用被表达且被纯化的H1L1。两者都与相同的蛋白质印迹反应。相同的蛋白质在四名从艰难梭菌引起的腹泻中恢复的患者中具有抗原性。
使用柱方法分离靶蛋白于37℃，在补充了巯基乙酸和L-半胱氨酸-HCl的脑心浸液肉汤中，厌氧培养艰难梭菌的临床分离株(本申请中指菌株CD14000287，分离自艰难梭菌感染患者)48小时。在Sorval RC-3B离心机中，以5000rpm离心细胞悬浮液20分钟以沉淀细胞，用PBS洗涤细胞颗粒一次，如上述再次沉淀。将经洗涤的细胞颗粒重悬于PBS中，并贮存于-20℃至进一步使用。解冻2ml冷冻细胞悬浮液的等分试样，在台式微量离心机上以14000rpm离心5分钟以沉淀所述细胞，将沉淀的细胞重悬于4ml的6M盐酸胍(pH8.0)中。通过于20℃，在Beckman L8-70M超速离心机上以45000rpm离心1小时，使胍萃取的蛋白质澄清。室温下，用2升的20mM碳酸钠缓冲液(pH9.5)透析上清液三次，以使萃取的蛋白质交换进入相容的缓冲液中用于AminoLink(Perbio提供)柱。按照厂商的使用说明(Perbio)，将于20mM碳酸钠(pH9.5)中的2ml H1L1抗体溶液(～2mg/ml)在预填充的2ml柱中与以20mM碳酸钠(pH9.5)平衡的AminoLink树脂共价结合。然后，将含有艰难梭菌抗原的萃取物(1.5ml)用于共价结合的H1L1柱上，并于室温用树脂温育1小时。用12ml的20mM碳酸钠缓冲液(pH9.5)洗涤未结合的物质过柱，用8ml的0.1M甘氨酸缓冲液(pH2.5-3.0)洗脱结合的抗原。用1M Tris(pH9.0)中和洗脱的蛋白质，然后在Amicon 15ml浓缩器连接管上浓缩至约200μl。然后通过10％(w/v)SDS-PAGE分析该浓缩的蛋白质物质，并通过考马斯蓝染色显影。然后，通过质谱鉴定与H1L1相互作用的蛋白质条带。
利用质谱鉴定分离的蛋白质从凝胶上切下蛋白质条带或斑点，于37℃用胰岛素进行消化。利用纳米电喷射飞行时间质谱对样品进行分析，得到SEQ ID NO42的序列。
从2D凝胶试验的样品中和使用基于柱的方法分离的蛋白质的样品中发现了相同的肽。
使用Sanger Institute(www.sanger.ac.uk/projects/C difficile/)的BLAST搜索搜索艰难梭菌基因组，得到匹配序列SEQ ID NO43。
理论pI5.74，分子量43430.30Da，其与在2D凝胶上的蛋白质(其中分子量为约44kD，pI5.5-6)的定位关系密切。
使用SEQ ID NO43的蛋白质序列，利用默认设置，在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/的蛋白质-蛋白质NCBI BLAST搜索中揭示出与乙酰辅酶A乙酰转移酶(硫解酶)登录号NP_349376有很高的相似性，即在391个氨基酸上有68％的相同性。
乙酰辅酶A乙酰转移酶的克隆为了在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的序列，将其从艰难梭菌基因组DNA中直接进行PCR扩增，并根据厂商的使用说明利用DNeasy旋转柱(Qiagen)进行制备。
通过直接与编码与乙酰辅酶A乙酰转移酶匹配的候选物的艰难梭菌基因组DNA序列进行比较而确定和设计所使用的PCR引物，即SEQ ID NO44和45，通过SIGMA Genosys合成。使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen)进行扩增，使得不需要连接而直接克隆到表达载体pBAD-TA(Invitrogen)中，将C-末端融合的六组氨酸-标记添加到位于阿拉伯糖诱导型启动子araBAD控制下的被表达的乙酰辅酶A乙酰转移酶上。将该克隆混合物转化到表达菌株TOP10(Invitrogen)中，利用SDS-PAGE鉴定重组体，使用单克隆抗-His-标记过氧化物酶-结合抗体(SIGMA)进行免疫印迹。所得到的质粒在本申请称为pThioll。
乙酰辅酶A乙酰转移酶的表达和纯化为了过表达6-组氨酸-标记硫解酶融合蛋白，将大肠杆菌菌株TOP10(pThioll)培养至指数生长末期(于37℃，200rpm振荡时OD6001.0)，通过添加阿拉伯糖至终浓度为0.2％诱导蛋白质表达。再培养240分钟后，通过离心(500g，10分钟，4℃)收集细菌，以1/20起始体积将沉淀重悬于裂解缓冲液(6M盐酸胍、50mM Tris-HCl pH8)中，并于室温混合1小时进行溶解。通过进一步的离心步骤(10000g，于室温10分钟)除去不溶性物质，按照厂商的使用说明将上清液用于Qiagen spin-prep Ni-NTA柱。用600μl的裂解缓冲液洗涤所述柱三遍，之后用600μl的洗涤缓冲液1(8M尿素、50mMTris/HCl pH8)洗涤三遍，再用600μl的洗涤缓冲液2(8M尿素、50mM TrisHCl pH8、25mM咪唑)洗涤三遍。用100μl的洗脱缓冲液(8M尿素、50mM Tris/HCl pH8、250mM咪唑)从柱上洗脱组氨酸-标记蛋白质，重复该洗脱步骤，合并两次级分。通过SDS-PAGE对样品进行分析。
抗体H1L1抗克隆的乙酰辅酶A乙酰转移酶试验将克隆并纯化的乙酰辅酶A乙酰转移酶与加样缓冲液和DTT以1∶1混合，然后在将其置于90℃的加热器上5分钟。利用NuPAGE-MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen)在10％BisTris凝胶(Invitrogen)上分离5-15μl上述物质35分钟。
将蛋白质转印至Invitrolon PVDF膜(Invitrogen Ltd，Carlsbad，CA，USA)上，并在含5％脱脂乳及0.1％Tween20的10mM PBS溶液中封闭1小时。将该膜与H1 L1以1∶10(浓度约400μg/ml)的比例在含0.1％Tween20的10mM PBS中温育1小时。用含0.1％Tween20的10mM PBS溶液洗涤三遍，每遍5分钟，然后用S蛋白HRP结合物(Novagen)以1∶1000温育1小时。用Sigma-Fast DAB染色显影印迹，所述印迹对正好位于50kD标记处的硫解酶条带显示出强应答。
因此，来自艰难梭菌感染患者的抗体集中于抗艰难梭菌乙酰辅酶A乙酰转移酶，从那些患者的主要轻链和重链CDR构建的合成抗体特异性地抗艰难梭菌乙酰辅酶A乙酰转移酶。因此，艰难梭菌乙酰辅酶A乙酰转移酶为强抗原，抗体H1L1可用于与其结合。
保守表位在丙酮丁醇梭菌的丁醇/丁酸酯产生路径中顺序存在三种酶，其也存在于艰难梭菌染色体上。发现这些酶与抗来自艰难梭菌上清液蛋白质所产生的兔抗血清相互作用(Mullany P et al.，FEMS MicrobiolLett.，1994Nov 15；124(1)61-7；PMID8001771)。
假定所述酶共享有保守表位，则可以发现唯一的同源区域存在于硫解酶(登录号P45362)的9-12位残基，该区域也存在于巴豆酸酶(登录号P45361)的5-8位残基，这一保守序列为SEQ ID NO47。
屎链球菌和艰难梭菌组合药物的MIC试验前准备在哥伦比亚血液琼脂平皿(CBA)上培养生物体以获得单菌落，并于37℃温育24小时(屎链球菌)或厌氧温育48小时(艰难梭菌)。
根据NCCLS方法(M7-6A)制备抗微生物剂，得到14种用于万古霉素和庆大霉素的浓度以及11种用于H1L1的浓度。在dH2O中制备万古霉素和庆大霉素的初始稀释液，首先将H1L1稀释到制剂缓冲液中(在100ml中3.484g精氨酸(200mM)、3.006g尿素(0.5M)，pH9.5)。随后，在使用的微生物的适当的生长培养基中制备稀释液。将制剂贮存于-20℃直至使用时。
浓度为所需终浓度的两倍。
1.培养基制备屎链球菌培养基-阳离子调节的Mueller Hinton Broth(NCCLSM7-6A)向1升Mueller Hinton Broth(OXOID，MHB)中加入2ml的10mg/ml CaCl2和500μl的10mg/ml MgCl2。
艰难梭菌培养基-(1)Supplemented Brucella Broth(NCCLS M1 1-A5)向900ml布氏肉汤粉末(SIGMA)中加入1ml氯高铁血红素(5mg/ml)和1mlVitamin K(1mg/ml)。加入高压灭菌后的100ml溶解的马血(5％)。
(2)根据厂商的说明制备强化梭菌培养基(RCM)将38g溶于1升dH2O中。
2.MIC平皿准备-表1药物1-万古霉素或庆大霉素(终浓度为0.0625μg/ml至512μg/ml)在U-形96孔微量滴定板中沿着所述微量滴定板的第一行从左至右以所需浓度的两倍加入万古霉素或庆大霉素(50μl)，最后一孔为空白的。对其它行使用浓度降低2倍的万古霉素重复这一操作。
药物2-H1L1抗体(终浓度为0.25μg/ml至256μg/ml)沿着列加入H1L1(50ml)。沿着第一列中加入所需浓度两倍的H1L1。对其它列，沿着平皿向前移动(从左至右)使用浓度降低2倍的H1L1重复这一操作。最后一列为空白的。
最后一列仅含有100μl的生长培养基。
按如上相同的方式，但是在另一个微量滴定板上，以万古霉素和庆大霉素的连续浓度进行操作。H1L1浓度与上述浓度完全相同，与列12中仅有培养基做对照一样。
接种物制备-直接的菌落悬浮液-在使用细菌前，立即制备接种物。
-通过将来自18-24小时(屎链球菌)或48小时(艰难梭菌)琼脂平皿的菌落重悬于适当的生长培养基或无菌生理盐水中制备直接的菌落悬浮液。
-根据NCCLS M7-6A(屎链球菌)和NCCLS M11-A5(艰难梭菌)，其可被调节至0.5 MacFarlands标准，然后以1∶10稀释于生长培养基中(约1×107cfu/ml)。
平皿接种--将如上制备的5μl的1∶10接种物悬浮液用于接种每一孔(最终接种物5×104cfu/ml)。
-从孔12至孔1接种所述板。
温育--于37℃温育所述板24小时(屎链球菌)或厌氧温育48小时(艰难梭菌)。
-为了检测接种物，将10μl生长对照稀释于10ml无菌盐水中(1∶1000)，将100μl涂抹于CBA平皿上，并于37℃温育24小时(屎链球菌)或厌氧温育48小时(艰难梭菌)。50个菌落相当于5×104cfu/ml。
读数结果MIC被定义为基本上抑制生物体生长的最低药物浓度。
通过用存在第二种药物的条件下的MIC除以不存在第二种药物的条件下的MIC计算每种药物的FIC(分级抑制浓度)。对于每种组合而言，这将产生两个分数，将其加合得到FICI(分级抑制浓度指数)值≤0.5被定义为协同，值＞0.5至＜4被定义为无差异，值≥4.0被定义为拮抗。
结果这些结果证实了H1L1与万古霉素和庆大霉素之间的协同作用。
结论这些结果证实了(i)H1L1和万古霉素，和(ii)H1L1和庆大霉素对艰难梭菌14000287和艰难梭菌NCTC11204的协同作用。这表明了在万古霉素耐药性屎链球菌中万古霉素和H1L1的协同作用。
艰难梭菌在存在可变短链脂肪酸(SCFA)和H1L1抗体浓度的条件下的生长SCFA制备使用的三种SCFA为乙酸、丙酸和丁酸。
如下将每种制备成1M的浓度将乙酸钠FW82.03-82.03g溶于1升dH2O中将丁酸钠FW110.09-110.09g溶于1升dH2O中将丙酸钠FW96.06-96.06g溶于1升dH2O中分别以70∶20∶10的比例混合这三种溶液。因此，在最终的溶液中，醋酸钠的浓度为0.7M，丁酸钠为0.2M，丙酸钠为0.1M。总SCFA的终浓度为1M。
利用强化梭菌培养基(RCM、DIFCO)从这一储备液制备浓度为5、10、20、30、40和50mM的总SCFA。
培养基制备根据厂商的说明制备强化梭菌培养基(RCM)将38g溶于1升dH2O中。
生长曲线试验前日在使用前，立即从厌氧条件移去培养物。将其暴露于好氧条件下不超过30分钟。
通过用来自经48小时培养的艰难梭菌的哥伦比亚血液琼脂平皿的菌落接种10ml RCM培养基制备艰难梭菌的过夜悬浮液。于37℃在厌氧条件下温育该悬浮液24小时。
试验日对照平皿如表4中所列，将对照溶液(200μl)加入平底96孔微量滴定板的孔中。每个对照使用3个孔。
检测平皿如下详述，将检测溶液(100μl)加入平底96孔微量滴定板的孔中，该滴定板的行被标记为A-H，列被标记为1-12。两种检测溶液，SCFA和H1L1，产生200μl的混合体积。每一检测使用2个孔。行A的孔含50mM SCFA、行B的孔含40mM SCFA、行C的孔含30mMSCFA、行D的孔含20mM SCFA、行E的孔含10mM SCFA、行F的孔含0.5mM SCFA。列1和2的孔含16μg/ml H1L1、列3和4的孔含8μg/ml H1L1、列5和6的孔含4μg/ml H1L1、列7和8的孔含2μg/mlH1L1、列9和10的孔含1μg/ml H1L1、列11和12的孔含0.5μg/mlH1L1。行G的孔为空的。给行H的所有孔中加入200μl RCM用作平皿的生长对照。
接种物制备在使用前，立即从厌氧条件移去培养物。将其暴露于好氧条件下不超过30分钟。
将处于培养的对数期后期的过夜悬浮液用于接种所述微量滴定板。除对照平皿上的培养基/阴性对照组外，给所有孔中加入20μl(约10％接种物)。
于37℃在厌氧条件下温育平皿24小时。
在0和24小时的时间点进行光密度读数(OD600nm)。确定平均OD600nm读数。
结果对照组-参见表5结论-1.10、20、30和40mM的SCFA本身没有影响，但是50mM的SCFA有一些降低。
2.0.5、1、2、4和8μg/ml的H1L1没有影响，但是16μg/ml的H1L1有抑制作用。
检测-参见表6结论-与1、2和4μg/ml H1L1和5mM SCFA(数据未显示)没有差异。8μg/ml H1L1和10-50mM SCFA的协同，光密度在24小时下降至0.296-0.330。16μg/ml H1L1和50mM SCFA的效果最为明显。
表1在这一阶段的药物浓度将为加入孔中的药物浓度的一半。(50μl+50μl＝1∶2稀释)。
A、B等＝万古霉素或庆大霉素1、2、3等＝+H1L1
表2
表3
表4
表5
表6
序 列 表<110>纽泰克医药有限公司<120>细菌感染的治疗<130>WA/MP101123WO<150>GB0414886.2<151>2004-07-02<160>47<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>126<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu1 5 10 15Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly20 25 30Ser Tyr Ser Trp Ser Trp Ile Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Phe Ile Tyr Tyr Thr Gly Tyr Thr Ser Tyr Lys Ser Ser50 55 60Leu Lys Ser Arg Val Ser Leu Ser Val Asp Thr Ser Asn Asp Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Glu Ile Arg Ala Pro Asp His His Asp Phe Ser Gly Tyr100 105 110Leu Gly Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>2<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens
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<223>putative sequence of antibody target<220>
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<222>(62)..(88)<223>match with SEQ ID NO42<400>43Ile Lys Leu Phe Lys Lys Gln Phe Arg Ile Tyr Glu Lys Ser Asn Leu1 5 10 15Met Gly Val Met Asn Met Arg Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Ala Arg20 25 30Thr Ala Val Gly Ser Phe Gly Gly Ala Phe Lys Ser Val Ser Ala Val35 40 45Glu Leu Gly Val Thr Ala Ala Lys Glu Ala Ile Lys Arg Ala Asn Ile50 55 60
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<223>PCR primer<400>45tctcttaact attaaagtag20<210>46<211>765
<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>coding sequence for antibody HlLl<400>46tgaggtgcag ctggtggagt ctggcccagg actggtgaag ccttcggaga ccctgtccct 60cacctgcact gtctctggtg gctccgtcag cagtggtagt tactcttgga gctggatccg 120ccagcgccca ggacagggcc tggagtggat tgggttcatc tactacactg ggtacacctc 180ctacaagtcg tccctcaaga gtcgagtctc cctgtcggtt gacacgtcta acgaccagtt 240ctccctgagc ctgagctctg taactgccgc ggacacggcc gtgtattact gtgcgaggga 300aattcgtgcc ccagatcacc atgattttag tggttatctc ggccgctggg gccagggaac 360cctggtcacc gtctcctcag gcgcgccggg tggtggcggc agcggtggcg gtggcagcgg 420tggcggcggt agcgctagct tcttctgagc tgactcagga ccctgctgtg tctgtggcct 480tgggacagac agtcaggatc acatgccaag gagacagcct cagaagctat tatgcaagct 540ggtaccagca gaagccagga caggcccctg tacttgtcat ctatggtaaa aacaaccggc 600cctcagggat cccagaccga ttctctggct ccagctcagg taacacagct tccttgacca 660tcactggggc gcaggcggaa gatgaggctg actactactg taactcccgg gacagcactg 720gtaaccagct gttcggcgga gggaccaagg tcaccgtcct aggta 765<210>47<211>4<212>PRT<213>Clostridium difficile<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(4)<223>C.difficile thiolase conserved epitope<400>47Val Val Ile Ala权利要求
1.乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂在制备用于治疗或预防艰难梭菌感染的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶来自艰难梭菌。
3.根据前述任一项权利要求的用途，所述抑制剂为抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3的用途，所述抗体或其抗原结合片段特异性地抗由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位。
5.根据权利要求3或4的用途，所述抗体或其抗原结合片段具有VH链互补决定区(CDR)1-3，其分别具有SEQ ID NO2-4的序列。
6.根据权利要求5的用途，所述抗体或其抗原结合片段的VH链具有SEQ ID NO1的序列。
7.根据权利要求3-6中任一项的用途，所述抗体或其抗原结合片段具有VL链互补决定区(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。
8.根据权利要求7的用途，所述抗体或其抗原结合片段的VL链具有SEQ ID NO16的序列。
9.根据权利要求7的用途，所述抗全体或其抗原结合片段的VL链具有SEQ ID NO16的序列。
10.根据前述权利要求任一项的用途，所述药物还包含至少一种选自庆大霉素、万古霉素和甲硝唑的抗生素。
11.用于治疗艰难梭菌感染的组合制剂，包含(i)乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂；和(ii)至少一种选自庆大霉素、万古霉素和甲硝唑的抗生素。
12.分离的和/或纯化的抗体或其抗原结合片段，其由下组中的至少一个组成(i)VH链互补决定区(CDR)1-3，其分别具有SEQ ID NO2-4的序列；和(ii)VL链互补决定区(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。
13.根据权利要求12的分离的和/或纯化的抗体或其抗原结合片段，所述VH链具有SEQ ID NO1的序列。
14.根据权利要求12或13的分离的和/或纯化的抗体或其抗原结合片段，所述VL链具有SEQ ID NO16的序列。
15.根据权利要求12的分离的和/或纯化的抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有SEQ ID NO41的序列。
16.编码根据权利要求15的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
17.根据权利要求16的核酸分子，其具有SEQ ID NO46的序列。
18.乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂和万古霉素在制备用于预防或治疗屎链球菌和粪链球菌感染的药物中的用途。
19.根据权利要求8的用途，所述屎链球菌或粪链球菌具有抗万古霉素抗性。
20.根据权利要求18或19的用途，所述乙酰辅酶A乙酰转移酶来自艰难梭菌。
21.根据权利要求18-20中任一项的用途，所述抑制剂为抗体或其抗原结合片段。
22.根据权利要求21的用途，所述抗体或其抗原结合片段特异性地抗由具有SEQ ID NO47的序列的肽所展示的表位。
23.根据权利要求21或22的用途，所述抗体或其抗原结合片段具有VH链互补决定区(CDR)1-3，其分别具有SEQ ID NO2-4的序列。
24.根据权利要求23的用途，所述抗体或其抗原结合片段的VH链具有SEQ ID NO1的序列。
25.根据权利要求21-24中任一项的用途，所述抗体或其抗原结合片段具有VL链互补决定区(CDR)1-3，其具有SEQ ID NO17-19的序列。
26.根据权利要求25的用途，所述抗体或其抗原结合片段的VL链具有SEQ ID NO16的序列。
27.根据权利要求21的用途，所述抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO41的序列。
28.用于治疗屎链球菌或粪链球菌感染的组合制剂，包含(i)乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂；和(ii)万古霉素。
29.治疗艰难梭菌感染的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂。
30.根据权利要求29的方法，还包括施用治疗有效量的至少一种选自庆大霉素、万古霉素和甲硝唑的抗生素。
31.治疗屎链球菌或粪链球菌感染的方法，包括给有需要的患者施用治疗有效量的(i)乙酰辅酶A乙酰转移酶的抑制剂；和(ii)万古霉素。
32.根据权利要求31的方法，所述屎链球菌或粪链球菌具有抗万古霉素抗性。
全文摘要
本发明涉及用于治疗艰难梭菌(Clostridium difficile)感染的化合物、药物和治疗方法，以及新的分离的抗体和它们在治疗艰难梭菌感染中的用途。本发明还涉及治疗和预防屎链球菌(E.faecium)和粪链球菌(E.faecalis)感染，并提供用于治疗和预防屎链球菌和粪链球菌感染的药物和治疗方法。
文档编号A61K39/395GK101014621SQ200580022389
公开日2007年8月8日 申请日期2005年7月1日 优先权日2004年7月2日
发明者詹姆斯·彼得·伯尼, 露斯·克里斯蒂娜·马修斯, 特雷西·卡特 申请人:纽泰克医药有限公司