专利名称：水稻根尖特异表达基因OsRTS3的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体的说，本发明涉及克隆水稻0sRTS3(riCe root tip specific 3)基因编码区的上游启动子核苷酸序列，该序列的功能在于能启动下游编码基因在水稻根尖静止中心的特异表达。
背景技术：
根系是植物吸收水分、养分的重要器官。根的结构大致可分为四部分根冠、分生区、伸长区和根毛区。细胞在分生区中不断分裂增殖，新生的细胞分化和发育，形成根的各种组织。发育中的细胞体积增加，组成伸长区。发育完成的细胞体积不再迅速增加，在表皮位置的细胞上发生毛状突起，组成根毛区。伸长区细胞体积增加形成压力推动分生区向前移动，部分分生区细胞分化并覆盖在根的尖端，起到保护和引导的作用，成为根冠。根尖由分生区和根冠组成，其核心为静止中心。静止中心细胞具有分化为其它细胞的潜在活性，以此为基础产生组成根尖的表皮、皮层、中柱鞘、中柱、根冠细胞。研究根尖细胞的分化与发育，对了解、控制和改良根系的性状具有重要意义。根系的发育是一个复杂的过程。目前的研究主要是基于双子叶模式植物拟南芥 (Arabidopsis thaliana)的根系相关突变体展开的，而以水稻(Oryza sativa)为模式植物的禾本科作物的根系发育机制研究较少。遗传转化技术是利用优良基因(尤其是外源基因)改良物种的一条重要途径。通过遗传转化技术改良物种除需要优良基因资源外，还需要适用于目标基因在最佳状态下发挥功能的启动子。国际国内可供选择用于农作物性状改良的功能基因的数量逐渐在增加。但是与之相比，可供选择的启动子数量和种类却非常有限，尤其缺乏适用于改良农作物性状的启动子。启动子已经成为采用遗传转化技术改良物种的瓶颈之一。目前国际国内用于农作物遗传转化的启动子主要是玉米泛素(ubiquitin)基因启动子、水稻肌动蛋白 (actin)基因启动子、病毒35S等组成型表达启动子。它们调控目标基因在所有组织中都表达，而且没有时空限制。用这些启动子调控目标基因表达时，由于大量目标蛋白在不需要的细胞中出现，往往容易造成物种形态和生理功能异常。虽然国际上也有少量特异启动子分离克隆的报道，但是涉及的农作物的种类很少，数量非常有限，而且我们不具有知识产权， 将受限于生产应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子， 利用该启动子(0sRTS3基因启动子)能启动外源基因在水稻根尖静止中心特异表达。为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子，该启动子为SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。作为本发明的水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子的改进启动子还包括在 SEQ IDNO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。作为本发明的水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子的进一步改进启动子还包括是在高严谨条件下可与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列杂交、且具有相同功能的核苷酸序列。本发明还同时公开了上述水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子的用途用于组织特异表达细胞标记。本发明的启动子是水稻根尖特异表达基因0sRTS3的基因编码区的上游序列。通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到转基因水稻中，对转基因材料的普通叶、 剑叶、花和根等多种不同组织进行了 GUS组织化学染色检测，结果证实了该启动子仅在根尖分生区特异表达，并进一步明确该启动子的表达位置集中于静止中心附近。利用本发明的启动子构建转基因水稻，具有如下优点可以启动下游基因特异性地表达于静止中心附近，而不启动该基因在根其它部位的表达。这种特性有助于以连接荧光蛋白等报告基因的方式将上述位置的细胞与周围的其它细胞区分开来。在本发明中，我们在0sRTS3启动子的下游连接了一个报告基因(⑶S).由于⑶S表达的部位可被染成蓝色，所以可以直观显示出启动子的组织特异性。该专利的应用旨在将来启动子下游接上特定的荧光标记基因，使之特异表达于静止中心附近，便于在活体条件下研究基因在植物根系早期发育中调控和互作关系。这种仅针对特定组织或细胞的靶向性遗传标记对相关研究具有很大的技术储备价值。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图 1 是 pBIlOl. I-GUS plus 载体示意图。图 2 是 pCAMBIA-GUSplus 载体示意3是0sRTS3启动子融合⑶S基因转基因材料的染色结果。图中A，体视镜照片显示0sRTS3启动子在根尖静止中心特异表达；B，树脂切片显示0sRTS3启动子在静止中心附近表达；C，根尖组织结构划分。bars = 500 ym(A)，bar = IOOym(B)。
具体实施例方式本发明的以下实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。在Ausubel编写白勺 John Wiley and Sons 公司出片反的 Current Protocols in Molecular Biology，禾口 J· Sambrook 等编写 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出片反白勺 Molecular Cloning :A Labortory Manual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。实施例1、根据相关研究，获知0sRTS3可能为根尖组织特异表达基因。根据0sRTS3基因编码区的上游序列设计特异引物，以野生型Nipponbare的基因组DNA为模板，扩增出全长 2607bp的0sRTS3基因启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO 1所示(即如序列表所述)。引物序列如下上游弓丨物AGGCCGAAAGACTAAGAGTTGAG
下游弓丨物ATACCATGGAACGGCTGCATAACTAA野生型Nipponbare的基因组DNA的提取方法为将野生型水稻品种Nipponbare叶片用液氮冷却研磨粉碎，用CTAB法提取基因组 DNA,具体过程如下1)往粉碎的组织中加入65°C预热的2-ME/CTAB，混合使之充分湿润，于65°C育 10 60min，不时混勻。2)用等体积的M 1氯仿/辛醇或氯仿/异戊醇抽提勻浆液，颠倒使充分混合， 于4°C，7500g离心5min，回收上层水相。3)在回收的上层相中加入1/10体积的65°C的CTAB/NaCl溶液，颠倒混勻。4)用等体积的氯仿/辛醇抽提，混勻，离心，回收上层水相。5)加入等体积的CTAB沉淀液，颠倒混勻。6)于 4"C，500g 离心 5min。7)移出上清，用高盐的TE缓冲液重悬沉淀，如果沉淀难于重悬，于65°C温育 30min,重复直至所有的或大部分沉淀溶解。8)加入0. 6体积的异丙醇沉淀核酸，充分混勻，于4°C 7500g,离心15min。9)用80%乙醇洗涤沉淀物，干燥，用尽可能少的TE缓冲液重悬(每克起始材料 0. 1 0. 5mL)。利用Prime Star DNA Polymerase把整个启动子DNA序列扩增出来利用 Takara 公司的 Prime Star DNA Polymerase,以野生型 Nipponbare 的基因组 DNA为模板(稀释20倍)扩增0sRTS3启动子序列。反应体系如下
5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus) 4 μ 1 dNTP Mixture (各 2.5 mM) 1 μ 1 上游引物(ΙΟμιη) Ιμ 下游引物(ΙΟμιη) Ιμ 基因组DNA模板 μ
无菌去离子水11.8 μ 1PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1) 0· 2 μ 1。在PTC200型PCR仪上进行PCR扩增，反应条件如下1)94°C 2min,2) 94 °C 10s3) 62-58 °C Ramp 2 V /s4) 72 °C 3min5)返回2)，循环30次6) 72 °C 7min7)4°C 保存。PCR产物经纯化和Pstl/Ncol酶切后在0. 8 %琼脂糖凝胶上电泳并割胶回收目的条带，回收的DNA片段经Xba I/Nco I酶切插入同样经Xba I/Nco I酶切的
5pCAMBIA1300-GUSplus载体(图1)，连接产物热击转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂板培养。随机挑取若干菌落，经摇菌、抽提质粒、)Cba I/Nco I酶切、电泳检测，挑取可切出正确长度DNA片段的阳性单克隆测序。鉴定出的正确克隆经)(ba I/EcoR I酶切，切出的片段连接到同样经)(ba I/EcoR I酶切的ρΒΙΙΟΙ. I-GUS plus载体(图1)，连接产物热击转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，涂板培养。随机挑取若干菌落，经摇菌、抽提质粒、Pstl/Mcl酶切、电泳检测，挑取可切出正确长度DNA片段的菌株为阳性单克隆。酶切鉴定为阳性的单克隆菌液扩繁后抽质粒，即为0sRTS3P-GUSplus质粒。该质粒电击转化入农杆菌EHA105感受态细胞。该农杆菌菌株用于水稻转基因。上述实验过程中使用的载体均为根据常用载体按照常规方法改造而来。将 PCAMBIA1305. 1上的⑶S plus序列用PCR的方法扩增出，上游引物5’端头加了 BamH I和 Kpn I酶切接头，下游引物5’端头加了 Mc I酶切接头。PCR产物用BamH I/Sac I酶切后连入用相同酶切的PBI101.3中，获得的载体称为ρΒΙΙΟΙ. I-GUS plus。所用引物序列为GUS plus-up AACGGATCCACGGTACCATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTCGUS plus-low ACGGAGCTCTCACACGTGATGGTGATGGTGATGGρΒΙΙΟΙ. I-GUS plus载体用Hind III/EcoR I切出含GUS基因的片段，连入用相同酶切的PCAMBIA1300载体中,所得的载体称为pCAMBIA1300_GUSplus。实施例2、水稻成熟种子经脱壳和消毒处理后放置在成熟胚诱导培养基上，在光照培养箱中培养3周。挑取自然分裂的胚性愈伤组织(淡黄色，致密呈球状)，置入继代培养基中， 在光照培养箱中继代培养，获得水稻愈伤。水稻愈伤经过0sRTS3P-GUSplUs质粒转化的农杆菌侵染、共培养、在含有G418抗生素的培养基上筛选。能够正常生长的愈伤经分化、 生根、练苗移栽，得到转基因植株，转基因植株。农杆菌(EHA1(^)介导的水稻遗传转化体系主要应用Hiei等人(1994)报道的方法基础上进行优化。获得的转基因苗后代用GUS染液染色后见图3所示。表明0sRTS3基因启动子驱动的⑶S在根尖静止中心特异表达。对比例1、花椰菜花叶病毒35S启动子为植物转基因常用的启动子。实施例2中使用的 0sRTS3P-GUSplus质粒即含有35S启动子，用于启动G418抗性基因。35S启动子可保证G418 抗性基因在包括愈伤组织在内的所有组织中表达，从而保证转入0sRTS3P-GUSplUs质粒的愈伤及其分化后的植株能够在含G418的培养条件下存活。若使用35S启动子替代0sRTS3 启动子，同样会导致外源基因(如GUQ在几乎所有组织中表达，从而失去组织特异性。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.水稻根尖特异表达基因^sTtTM的启动子，其特征在于该启动子为SEQID N0:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子，其特征是所述启动子还包括在SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
3.根据权利要求1所述的水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子，其特征是所述启动子还包括是在高严谨条件下可与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列杂交、且具有相同功能的核苷酸序列。
4.如权利要求1、2或3所述的水稻根尖特异表达基因0sRTS3的启动子的用途用于构建转基因水稻，其目的为建立水稻根尖特异表达品系。
全文摘要
本发明公开了一种水稻根尖特异表达基因OsRTS3的启动子，该启动子为SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了上述水稻根尖特异表达基因OsRTS3的启动子的用途用于构建转基因水稻，其目的为建立水稻根尖特异表达品系。本发明启动子的功能在于能启动下游编码基因在水稻根尖静止中心的特异表达。
文档编号C12N15/113GK102409052SQ20111009050
公开日2012年4月11日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者吴平, 张麝龙, 莫肖蓉 申请人:浙江大学