水稻根尖特异表达启动子POsRo3的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 根尖特异表达启动子P0sR〇3及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标 基因在水稻根中特异表达。
【背景技术】
[0002] 植物基因能够正常表达是依赖基因上游的启动子序列。在植物基因工程中， 我们可以利用具有不同表达调控水平的启动子来驱动目标基因的表达。其中在植物中 使用最广泛的启动子为CaMV35S启动子。该启动子是烟草花叶病毒基因的启动子，能 在大部分植物中对异源基因进行启动表达，是组成型启动子（ChuaNH，BenfeyPN.The cauliflowermosaicvirus35Spromoter:combinatorialregulationoftranscription onplants.Science，1990,250:959-966h从病毒中克隆出来的基因启动子序列应用 到植物基因工程中，可能存在潜在的生物不安全性，因此，人们也从植物本身克隆活性 强的组成型启动子。例如来源于拟南芥的PTSBl和PPHYB启动子（NaomiSS，Ichiro M..ConstitutivepromotersavailalefortransgeneexpressioninsteadofCaMV35S RNApromoter:Arabidopsispromotersoftryptophansynthaseproteinsubunitand phytochromeB.PlantBiotechnology，2002, 19(1) :19-26);广泛应用地单子叶植物转基 因工程中，并作为研究的水稻Actinl和玉米Ubiquitin启动子，据报道，这些启动子在大麦 和玉米中的表达效率是 35S的 15倍（SchledzewskiK，MendelRR.Quantitativetransient geneexpression:Comparisonofthepromotersformaizepolyubiquitinl,rice actinI,maize-derivedEmuandCaMV35Sincellsofbarley,maizeandtobacco. TransgenicRes.1994, 3:249-255) 〇
[0003] 尽管组成型启动子能高效、非特异性的启动外源基因表达，但在实际应用中逐渐 暴露出一些问题，这种外源基因的组成型表达往往会造成大量异源蛋白的积累，从而打 破植物原有的代谢平衡，妨碍植物的正常生长。例如生长迟缓、生长期长、甚至不育和死 亡（PinaMT,SkinnerJSjParkEJ，JekniZ,HayesPM,ThomashowMF，ChenT.Useofa stressinduciblepromotertodriveectopicAtCBFexpressioninprovespotato freezingtolerancewhileminimizingnegativeeffectsontuberyield.Plant BiotechJ，2007, 5:591-604h因此，能够驱动外源基因在植物组织器官中定时、定点表达 的组织特异性启动子逐渐成为研究的重点。
[0004] 植物根系在土壤养分吸收中起重要作用，并且能与土壤微生物相互作用、分泌抗 病虫物质以抵抗病菌对植物的侵袭。更重要的是，根系能够在各种非生物胁迫条件下保护 地上部分，如干旱、酸性条件及重金属。当与养分吸收和耐胁迫相关的基因被特异的表达在 根部细胞后，植物则会在营养匮乏及胁迫条件下正常生长。
[0005]目前在植物中，虽然已有少数根部特异表达的启动子被克隆并应用于基因功能的 研究，但这些启动子中大部分只是在根部表达较强，并不完全特异在根中表达。另外，能够 在水稻根尖特异表达的启动子更是鲜为人知。而根尖在植物根部中的作用又极其重要，由 此可见，发展更多的水稻等禾谷科作物的根尖特异型启动子对基础性研究和遗传改良应用 都具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻根中特异性表达的 启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。
[0007] 具体而言，本发明提供一种水稻根尖特异表达启动子P0sR〇3,其特征在于，所述水 稻根尖特异表达启动子P〇sRo3提取自水稻属植物。
[0008] 优选地，所述水稻根尖特异表达启动子P0sR〇3包含：
[0009] 1)序列表中SEQIDNo:1或2所示的DNA序列；或者
[0010] 2)在严格条件下与含有1)中的DNA序列杂交后具有启动子功能的DNA序列；或 者
[0011] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有70%-75%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0012] 4)与1)或2)限定的DNA序列具有75%-80%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0013] 5)与1)或2)限定的DNA序列具有80%-85%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0014] 6)与1)或2)限定的DNA序列具有85% -90%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0015] 7)与1)或2)限定的DNA序列具有90% -95%的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0016] 8)与1)或2)限定的DNA序列具有95%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 序列；或者
[0017] 9)在SEQ ID NO: 1或2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0018] 10)在SEQIDNO: 1或2中所示的核苷酸序列中去除一个或多个核苷酸后所获得 的具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0019] 11)在SEQIDNO: 1或2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得 的具有启动子功能的核苷酸序列。
[0020] 优选地，所述水稻根尖特异表达启动子P0sR〇3提取自日本晴水稻，所述水稻根尖 特异表达启动子P〇sRo3由SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列构成。
[0021] 另一方面，本发明提供一种含有所述水稻根尖特异表达启动子P0sR〇3的重组表 达载体或表达盒。
[0022] 优选地，所述重组表达载体为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的水稻根尖 特异表达启动子P0sR〇3得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述水稻根尖特异表达 启动子P〇sRo3连接于载体中待表达的基因序列的上游。在一种实现方式中，所述待表达的 基因为Gus基因。该重组表达载体为将SEQIDNo:l所示的序列即P0sRo3或启动子P0sRo3 构建于PCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-P0sRo3。或者待表 达基因可以为任何对水稻根尖具有改善功能的基因。
[0023]优选地，所述待表达基因为具有改善水稻根性状能力的基因。
[0024]另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的宿主菌的方法，其特征在 于，所述方法包括将包含所述的水稻根尖特异表达启动子P〇sRo3、所述的重组表达载体、或 所述的表达盒转入根癌农杆菌。
[0025]另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的转化子的方法，其特征在 于，所述方法包括将所述水稻根尖特异表达启动子P0sR〇3转入大肠杆菌XL-Blue感受态细 胞中，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，将所获得的阳性克隆和植物载体构建植物表达载体， 再将所述植物表达载体转入根癌农杆菌，并利用所述根癌农杆菌通过介导方法获得转基因 植物细胞、组织、器官或植株。
[0026] 另一方面，本发明提供一种所述水稻根尖特异表达启动子P0sR〇3在培育转基因 植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述水稻根尖特异表达启动子P0sR〇3连接 于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水 稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为水稻雌蕊特异表达基因。
[0027] 另一方面，本发明提供一组扩增所述水稻根特异性强表达启动子P0sR〇3的全部 或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物 的核苷酸序列如SEQIDNO:3所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。
[0028] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)的根特异性强表达启动子，本文中称为P0sRo3或启动子P0sRo3。具体而 言，本申请的发明人发现日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括转录 起始位点在内的1807bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻根中特异性表达的功能，并且 分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。
[0029] 需要说明的是，本发明所提供的启动子序列中，SEQIDNo. 1中序列开头的 "ACTTTCTTGTTGTCCATTCCAT"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp; 序列末尾的序列"CTACCGCACCAACAGTTAATAA"为获得启动子过程中使用的反向引物的留存 序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp;该DNA序列中剩余的部分则 为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整 个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列，即SEQIDNo.2。需要说明的 是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发 明的保护范围之内。
[0030] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)P0sRo3基因上游包括转录起始位点在内的1807bp的DNA序列，并将其命名 为启动子P〇sRo3。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应 的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆 菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus组织 化学染色检测发现，转基因植株的根特别是根尖部位Gus基因显著表达，而其他部位如茎 叶等中均没有明显的GUS活性，从而证明该1807bp的序列具有驱动基因在根尖部位特异性 表达的活性。
[0031] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在水 稻的根部位特异性的驱动靶标基因的表达，增加转基因的效果，避免不必要部位表达带来 的物质能量浪费，有效改良水稻的特性。
[0032] 技术效果
[0033] 本发明所克隆的水稻启动子P0sR〇3能够调控基因在水稻根尖中特异性集中表 达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造改善植物根尖 的生长特性，如通过该启动子驱动目标基因在植株根尖中表达，例如，可以增强根发育过程 中对环境的抵抗力，比如耐寒性、耐热性等等，从而培育出理想的转基因植物品种。
【附图说明】
[0034] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0035] 图1为将P0sRo3启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A