专利名称：水稻蔗糖输送基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及以植物维管束组织，特别是单子叶植物维管束组织，更特别是维管束韧皮部为靶基因系统，更具体地说，本发明涉及具有蔗糖输送基因启动子活性的碱基序列DNA、表达盒以及通过它们进行转基因的转基因植物。
背景技术：
众所周知，一般地，植物维管束是用来运输光合作用产物或水分的器官但是维管束不仅仅具有这些功能，最近有报道说，维管束在植物个体水平上与信息传递或植物形态的形成有关。目前已知存在于维管束组织内的蛋白质有蔗糖输送蛋白(以下，简称“SUT”)。通常认为该SUT在高等植物中是具有运输蔗糖(Sucorse)功能的膜蛋白，它通过与膜上的H+-ATPase偶联使质子(H+)作为主动运输的原动力从而进行蔗糖的主动运输。
所述SUT基因已经在以双子叶植物为主的多种植物中得到分离。从植物中分离得到SUT的最早报道植物为菠菜(Riesmeier JW，WillmitzerL，Frommer WB(1992)Isolation and characterization of a sucrose carrier cDNAfrom spinach by functional expression in yeast.EMBO J 114705-4713)。
目前已经在双子叶植物如马铃薯，证实了经分离的SUT在维管束韧皮部具有特异性的表达(Riesmeier JW，Hirner B，Frommer WB(1993)Potatosucrose transporter expressionin minor indicates a role in phloem loading.PlantCell 51591-1598)。有报道说，大车前(Gahrtz M，Stolz J，Saner N(1994)A phloem-specific sucrose-H+symporter from Plantago major L.supports themodel of apoplastic phloem loading Plant J.6697-706)、鼠耳芥(Saner N，StolzJ(1994)SUC1 and SUC2two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana；expression and characterization in baker’s yeast and identification of thehistidine-tagged protein.Plant J 667-77)，后来又在拟南芥属、番茄、豌豆等植物中的韧皮部证实了其特异性表达。
关于上面所述的双子叶植物拟南芥属植物的启动子已经得到了分离，同时又用「启动子GUS」以及「启动子GFP转化体」分析了表达系(TruernitE，Saner N(1995)The promoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+symporter gene directs expression of b-glucuronidase to the phloemEvidencefor phloem loading and unloading by SUC2.Planta 196564-570Imalau A.，Truernit E.，Sauer N.(1999)Cell-to-cell and long-distance trafficking of the greenfluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein intosink tissues.Plant Cell 11309-322)。
另一方面，单子叶植物的SUT基因最早是在水稻中分离得到的(HiroseT，Imazumi N，Scofield GN，Furbank RT，Ohsugi R(1997)cDNA cloning andtissue specific expression of a gene for sucrose transporter from rice(Oryzasativa L.).Plant Cell Physiol 381389-1396)。后来，又在玉米等中分离得到(Aoki N.，Hirose T.，Takabashi S.，Ono K.，Ishimaru K.，Ohsugi R.(1999)Molecular cloning and expression analysis of a gene for a sucrose transporter inmaize(Zea mays L.)Plant Cell Physiol.401072-1078)。
至此，单子叶植物中已经在韧皮部确认有SUT基因表达的只有水稻(Matsukura C.et al.，2000，Plant Physiol.12485-94)。另有一篇报道虽然不是关于SUT的报道，但是RPP13-1基因已经分离并与其启动子共同显示韧皮部特异性的表达(Ishiwatari Y，Fujiwara T，Mcfarland KC，Nemoto K，Hayashi H，Chino M，Lucas WJ(1998)Rice phloem thioredoxin h has thecapacity to mediate its own cell-to-cell transport through plasmodesmata.Planta20512-22)。
除上述外，未见关于SUT基因启动子的报道，但是关于控制韧皮部特异性表达的启动子有若干报道(美国专利第5,495,007号、德国专利第4,306,832号、国际公开公报WO93/04177、WO92/22582、WO91/09050、WO00/11197)。
发明内容
近年来，在植物转基因技术中，不是要求有关传统的所有组织或正常表达系统，而是要求利用组织、器官、生长发育期特异性启动子进行基因表达的系统。尤其是以病原菌、病毒感染途径的维管束组织作为靶子建立一种可利用的基因表达体系，并期待着这种体系的建立可成为一种强有力的技术手段进行改善例如，赋予抗病性、因转基因而改变维管束运输能力、改良植物株型等。
特别是在重要农作物中，例如水稻，建立以杀虫蛋白、抗病毒蛋白质抗病蛋白质等目的基因的维管束为靶子建立特异性表达系统是极为有意义的，另外，不仅如此，还希望以改善维管束介导的运输糖类环境为目的，使糖代谢(蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶等)-糖类运输(SUT、H+-ATPase等)体系的蛋白质或编码糖类信号传递因子的基因在维管束内特异性表达，或者除此以外，通过筛管运输物质并表达特定蛋白质。
鉴于上述，在高等植物水稻中，研究控制启动子特性并以维管束组织作为靶组织构建一种能够表达所需的基因的基因表达系统是工业上极为重要的。但是，此前并没有分离得到单子叶植物SUT基因的启动子，且在单子叶植物中在维管束韧皮部很少报道关于特异性启动子。
因此，本发明的目的就是从主要的单子叶植物维管束组织，尤其是水稻维管束组织中特异地，特别是在其韧皮部分离一种具有特异活性的启动子。本发明的另一目的是，应用该SUT基因启动子的调控特性，提供一种施以上述改进方法的转基因植物。本发明更进一步地，提供转基因植物的培育方法和用于该方法的表达载体及表达盒。
图1表示包含OsSUT1启动子的GUS表达载体的构建说明。
图2表示水稻叶片-叶鞘的维管束走向状态。图2a表示水稻叶子维管束走向的模式图，图2b为图2a的部分组织放大照片，而图2c为在叶的横切面上看到的横向维管束的放大照片。
图3为通过GUS染色法显示的OsSUT1-promoter-1活性照片。图3a为叶表面放大照片，图3b为根的放大照片，图3c为叶的横切面的放大照片，图3d为根的横切面的放大照片。图中，L、M、T以及cc分别表示大的维管束(纵向)、小的维管束(纵向)、横向维管束以及韧皮部的伴胞。
图4为通过GUS染色法显示的OsSUT1-promoter-2活性的照片。图4a为叶表面放大照片，图4b为根的放大照片，图4c为叶的横切面的放大照片，图4d为根的横切面的放大照片。图中，L、M以及T分别表示大的维管束(纵向)、小的维管束(纵向)和横向维管束。
图5为通过GUS染色法显示的OsSUT1-promoter-3活性的照片。图5a为叶表面放大照片，上图表示GUS表达但没有表达维管束特异性的个体，下图表示没有GUS表达的个体。图5b为图5a的叶横切面的放大照片，图5c为根的横切面的放大照片。图中，L、M以及T分别表示大的维管束(纵向)、小的维管束(纵向)和横向维管束。
图6为通过GUS染色法显示的在OsSUT1-promoter-1抽穗期的节和节间的活性。图6a为抽穗期的节的横切面照片。图6b以及图6c各自为图6a中节的部分放大照片。图6d为抽穗期节间表面的放大照片，左图为分化带，中央为伸长带，右图为成熟带。图6e表示节间中的分化带、伸长带、成熟带位置的模式图。图中，VB为维管束，P为韧皮部，X为木质部。
图7为通过GUS染色法显示的在OsSUT1-promoter-1开花期的花器活性。图7a和图7b分别为开花前包括颖片在内的花器放大照片，图7c和图7d分别为开花后包括颖片在内的花器的放大照片。图7e表示花器构造的模式图。图中，L为浆片，P为雌蕊。
图8为通过GUS染色法显示的在OsSUT1-promoter-1开花、成熟期的花器活性照片。图8a为开花前的柱头，图8b为开花后第3天的子房，图8c为开花后第10天的果皮维管束，图8d为开花前的柱头纵切面，图8e为开花后第3天的子房壁的横切面，图8f为开花后第10天的果皮维管束韧皮部的横切面。
图9下划线表示OsSUT1-promoter-1在SEQ ID NO1中所对应的碱基序列的位置。
图10下划线表示OsSUT1-promoter-2在SEQ IDNO1中所对应的碱基序列的位置。
图11下划线表示OsSUT1-promoter-3在SEQ ID NO1中所对应的碱基序列的位置。
具体实施例方式
本发明人经过悉心研究，在水稻(Oryza sativa L.；葵之风品种)的基因组文库中首次鉴定出具有OsSUT1基因启动子活性的DNA并证实了该DNA的碱基序列，同时，发现了该启动子可以把连接于该启动子下游的结构基因特异性地在植物维管束韧皮部或者在花期维管束内表达，又成功地制备出在所述启动子下游连接外源结构基因的表达盒和包含该表达盒的载体以及通过它们确确实实地培育出转基因植物，进而完成本发明。
同时，本发明人还发现，上述碱基序列5′端部分缺失的话，则失去了韧皮部特异性在整个维管束组织中的表达，以及基因表达期的特异性也发生了变化。由此预示，OsSUT1基因启动子在5′端和3′端具有不同的性质，利用其性质的差异，可以构建能够调控表达部位以及表达时期的表达系统。
启动子总之，本发明提供一种DNA，该DNA包含存在于序列表SEQ ID NO1所示碱基序列中的启动子序列。本说明书中所述“启动子”，一般表示位于结构基因转录起始点的上游并司管该基因表达的碱基序列，例如还包括增强子等转录调节序列。
OsSUT1-promoter-1更具体地说，存在于序列表SEQ ID NO1所示碱基序列中的第一启动子命名为“OsSUT1-promoter-1”，即一种DNA，该DNA片断由如下碱基序列所组成在SEQ ID NO1中自“第285位上的T乃至第296位上的G”至“第1088位上的G乃至第1403位上的C”之间的碱基序列；或者是上述碱基序列中自5′末端至第947位上的G中有部分缺失的碱基序列，所述DNA具有很强的位点特异性启动子活性，所述位点以植物维管束韧皮部作为靶子。所述启动子的活性不仅在绿叶或根部，在抽穗期-开花期的节或节间以及花器中都具有维管束韧皮部特异性和时期性的启动子活性。
本发明进一步地提供一种DNA，该DNA在高度严谨条件下与OsSUT1-promoter-1杂交，实质上与启动子活性相同，特别是在维管束韧皮部组织内特异地保持启动子活性。
本发明又进一步提供一种DNA，该DNA由在OsSUT1-promoter-1碱基序列中有1个至数个碱基被插入、添加、缺失或取代的碱基序列所组成，它实质上与启动子活性相同，特别是在维管束韧皮部组织内特异地保持启动子活性。
本发明又进一步提供一种DNA，该DNA与OsSUT1-promoter-1碱基序列同源性高且与OsSUT1-promoter-1实质上具有相同的启动子活性，特别是在维管束韧皮部组织内特异地保持启动子活性。所述DNA碱基序列的同源性至少为80％、优选至少85％、再优选至少95％。同源性的％可以通过，例如Altschul等的Nucl.Acids.Res.25.，p.338％3402(1997)记载的BLAST程序进行确定。BLAST程序也可通过互联网检索得到。
OsSUT1-promoter-2存在于序列表SEQ ID NO1所示碱基序列中的第二启动子命名为“OsSUT1-promoter-2”，即一种DNA，该DNA由SEQ ID NO1中的“第948位上的T至第1403位上的C”的碱基序列组成，该DNA片断具有植物维管束组织特异性启动子活性。所述启动子虽然在韧皮部特异性很低，但仍保持植物维管束组织的特异的启动子活性，例如在绿叶或根部的维管束韧皮部、木质部、维管束薄壁细胞里都具有特异的启动子活性。尤其是所述启动子的维管束组织特异性活性与上述的第一启动子比较，很少依赖于植物的发育期和其器官。
本发明进一步提供一种DNA，该DNA在高度严谨条件下与OsSUT1-promoter-2杂交，实质上保持相同的启动子活性，特别是在维管束组织内保持特异的启动子活性。
本发明又进一步提供一种DNA，该DNA由在OsSUT1-promoter-2碱基序列中有1个至数个碱基被插入、添加、缺失或取代的碱基序列所组成，它实质上与启动子活性相同，特别是在维管束组织内特异地保持启动子活性。
本发明又进一步提供一种DNA，该DNA具有很高的OsSUT1-promoter-2碱基序列同源性且与OsSUT1-promoter-2实质上具有相同的启动子活性，特别是在植物维管束组织内特异地保持启动子活性。所述DNA碱基序列的同源性至少为80％、优选至少85％、再优选至少95％。同源性的％可以通过，例如Altschul等的Nucl.Acids.Res.25.，p.3389-3402(1997)记载的BLAST程序进行确定。BLAST程序也可通过互联网检索得到。
另外，SEQ ID NO1中的第1119～1125位的TATTATA推测为TATAbox。因此，在本发明实施方式中优选OsSUT1-promoter-1及OsSUT1-promoter-2都涵盖到SEQ ID NO1中第1125位上A的前后。
启动子的合成有关本发明的OsSUT1启动子的分离、纯化、克隆、表达载体的构建、植物细胞的转化以及再生等除了本说明书公开的实施例以外，通过参照基因工程学中已知的技术对于本领域普通技术人员来说，都可以实施。其详细的实验方法参照本说明书中引用的文献等对于本领域普通技术人员来说，很容易理解。
本发明具有OsSUT1启动子活性的DNA一个例子可通过如下获得。自单子叶植物，优选自禾本科植物(Oryza sativa L.)的DNA基因组文库，以SEQ ID NO1所示的碱基序列的适当部分、包括该启动子活性部分的全部或一部分作为探针，采用集落杂交等方法，可以进行筛选。目的DNA可以从菌落中筛选，该菌落包含与探针杂交的，例如约1000bp左右长的DNA片断。
杂交条件为“高度严谨条件”，也就是说，在杂交缓冲液(0.5MNa2HPO4，7％SDS，1％聚乙烯吡咯烷酮)中温度约至少为63℃，优选约至少为65℃。通过在这样一种杂交条件下至少重复2次筛选，优选重复至少3次，即可得到与上述OsSUT1-promoter-1或OsSUT1-promoter-2碱基序列相同的启动子或具有很高同源性的启动子，例如至少85％、优选至少95％的碱基序列，并实质上具有相同的启动子活性。
另外，为了获得包括上述OsSUT1-promoter-1或OsSUT1-promoter-2碱基序列的1个至数个碱基被插入、添加、缺失或取代的DNA碱基序列，自OsSUT1-promoter-1或OsSUT1-promoter-2中，或者自两者的同源性DNA中，例如根据定位诱变法很容易获得。这种突变体也可通过定位诱变法以外的，本领域普通技术人员已知的任意方法进行诱变。
将得到的DNA片断通过已知PCR法扩增，确定碱基序列，然后比较SEQ ID NO1的碱基序列，由此可以确认目的启动子。
为了直接确认DNA片断启动子活性，在该启动子的3′端下游连接报道基因，并制备含有该报道基因的表达载体从而导入植物细胞中。在转基因植物中可检测基因表达的报道基因包括鉴定既简单又可定量的GUS、LacZ、Cat基因、还包括可以进行组织特异性鉴定的所述GUS和GFP基因等，它们可适用于公知的检测方法。活性研究结果表明，所述DNA片断明显具有表达特异性时，DNA序列可用作“启动子活性特定区的碱基序列”之一用于筛选以后所需的表达特异性。
表达盒和载体本发明具有启动子活性的DNA依其启动子活性，可与外源基因一起用作表达盒，所述外源基因应使维管束韧皮部、维管束或者器官或发育期特异性地表达。
所述「外源基因」，在上述维管束中，尤其在维管束韧皮部里只要在本发明启动子活性的DNA的调控下能够表达的，除了OsSUT1基因，任何基因均可，典型例子有在维管束中编码具有定位特异表达功能的蛋白质的基因。优选外源基因着眼于维管束成为感染途径的基因，该基因赋予植物抗病性蛋白质，特别是抗害虫蛋白质，抗细菌蛋白质或者抗病毒蛋白质。侧重于维管束组织形成对植物个体水平的形态形成具有重要作用，优选以整个维管束作为靶子控制草高和草株等的基因并使之表达。特别优选基因的例子可举例为有关赤霉素信息传递的GAI基因。
本领域普通技术员均晓得在启动子区3′端连接目的外源基因构建表达盒的方法。构建而成的表达盒在适当的载体(如pBSII或与其同类的载体)中扩增。扩增的表达盒，例如通过用于重组的中间载体依据同源重组方法可重组到植物细胞的基因组中。如此构建的表达盒可导入大肠杆菌中，使之扩增。再进一步把这些表达盒根据农杆菌和2种大肠杆菌(其中一种大肠杆菌保持有表达盒的特性)的3系杂交法导入到农杆菌内。
上述表达盒可适当地包含增强子序列、外源基因5′端以及3′端的非翻译区等。也可包含用于筛选转化体的标记基因。所述标记基因包括，抗抗生物质基因如四环素、氨苄青霉素或卡那霉素或新霉素、潮霉素、大观霉素等，除此以外，萤光素酶基因、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、β-乳胺酶、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)等。
向植物细胞内导入表达盒本发明提供一种转基因植物，该植物在通过上述表达载体转化的植物基因组上重组上述表达盒，依其启动子活性在维管束组织内，尤其是在其韧皮部内可特异地表达外源基因。
向植物细胞基因组内导入使用上述表达盒的外源基因的方法无需特殊限定，例如包括农杆菌法、电穿孔法、PEG法、微注射法、粒子枪法等。优选农杆菌法。其具体方法已经在例如PCT国际公开公报(WO92/13957)上公开。这正如后面实施例所给出的一样，应用农杆菌自然转化，优选将包含表达盒的中间载体转入农杆菌内，使该农杆菌感染植物，该转导是通过接合操作等完成的。所述农杆菌感染植物的方法作为本领域普通技术人员均晓得，包括例如植物体的一部分创伤，使细菌感染创伤部位的方法、在植物体的胚组织(包括未成熟胚)里感染细菌的方法、感染愈伤组织的方法、原生质体和细菌共培养的方法或者将叶片组织与细菌共同培养的方法(叶盘转化法)。
所得到的转基因细胞可将适当的标记作为标记物或者通过是否表达为所需的性状而从其它细胞中进行筛选。把转基因的植物细胞在再生培养基中培养成为一个完整的植物个体的方法，公开在例如Y.Hiei et al.，Plant J.6.271-2821984文献上。
利用本领域普通技术人员周知的方法可对获得的转基因植物进行分析。例如，以导入基因的DNA序列为模板合成寡核苷酸引物，将该引物进行PCR扩增可分析转基因植物的染色体DNA。同时还可分析与导入基因对应的，mRNA，或有无蛋白质表达。也可以根据植物体的外观(如当导入编码能产生局部坏死斑的蛋白质的基因时，局部坏死斑的有无或者局部坏死斑的大小、数目等)、抗病性(如病原菌接触时其有无抗性或者其抗性程度)等分析转基因植物。
因此，通过示例可根据以下步骤将外源基因与本发明启动子一起导入植物细胞的基因组中。
(a)提供本发明的启动子；(b)在上述启动子的下游连接所需的结构基因，根据需要，在该结构基因连接选择标记基因从而制备表达盒；(c)根据农杆菌法、电穿孔法、PEG法、微注射法或粒子枪法将上述表达盒导入植物的基因组中；(d)通过选择标记筛选被转化的植物细胞，进行愈伤组织培养；(e)将形成的愈伤组织用再生培养基培养直到长成完整的植物个体；(f)根据需要，通过给形成的植物进行自花授粉或异花授粉进行杂交育种培育出纯合型的转基因植物品种。
另外，本说明书中所说的“转化体”包括，通过本发明方法获得重组植物细胞，再通过把该植物细胞再生而成的植物转化体，和只要其特定的表达特异性能够维持并从该转化体得到的后代植物。本说明书中所说的“植物”又包括，除了特别说明外，均表示植物体(个体)，种子(包括发芽种子、未成熟种子)，器官或部分器官(如叶、根、茎、花、雄蕊、雌蕊、以及它们的一部分)，植物培养细胞，愈伤组织，原生质体。
发明效果本发明提供一种在高等植物中极其有用的启动子活性的DNA或含有该DNA的表达盒，还提供在维管束表达系中从来没有过的新型基因表达体系。
特别是，通过使用OsSUT1-promoter-1作为启动子，能使目的基因中在维管束韧皮部内进行特异性表达。再有OsSUT1-promoter-1以繁殖发育期(抽穗、开花的生殖器官以及节间、节)的维管束韧皮部伴胞作为靶子可有效地用作基因启动子。
再者，通过使用OsSUT1-promoter-2作为启动子，无论是生长发育期还是器官中在维管束组织内都可进行特异性表达。依此活性在植物个体水平上以维管束作为靶子进行的表达，例如有效地改善维管束的运输能力或改变草株等的表达体系作为目的。
还有，通过利用上述一系列启动子，过去很难筛选维管束特异启动子，而现在在维管束中可筛选出显微组织特异性(如韧皮部或木质部·维管束薄壁细胞)或发育期特异性并表达目的基因。
本发明所说的“维管束”包括具有运输光合作用产物或水分的通道器官的韧皮部(包含韧皮部伴胞或筛管液)以及木质部的维管束鞘(包含维管束薄壁细胞)，当然还包括支配水稻叶子走向的叶鞘或叶片等的纵向维管束以及横向维管束，还包括开花期或成熟期的各种器官，例如颖片、雌蕊(柱头)、花丝、浆片以及子房壁(果皮)等中存在的维管束(但在成熟初期，开花后3天左右在整个子房壁组织内均表达的)。所述“维管束特异性”是指，几乎在上述维管束鞘内的特异性，优选启动子在维管束内，特别是在韧皮部组织内的特异性。所述“发育期特异性”是指，节间伸长时的节或节间，抽穗或开花期以及成熟期的特定时期。当所述“发育期特异性”时，有时也指节或节间韧皮部的特异性或抽穗期或开花期的器官特异性，因此，同时兼备部位特异性和时期特异性的实施方式也包含在本说明书中所述的“表达特异性”中。
本发明启动子具有上面所述的特征，通过杀虫蛋白质、抗病毒蛋白质、抗病蛋白质等表达有效地赋予植物抗病虫害性。为了改善维管束介导的糖类运输环境，在维管束内，可有效地使编码糖代谢(蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶等)·糖类运输(SUT、H+-ATPase等)体系的蛋白质或编码糖信息传递因子的基因进行特异性表达。另外，为了通过筛管输送物质，在表达蛋白质时启动子仍具有意义的。
实施例OsSUT1基因组克隆的分离用基因组DNA提取试剂盒·ISOPLANT(Nippon gene)分离纯化水稻(Oryza sativa L.)“葵之风”品种绿叶的基因组DNA。用限制酶Sau3AI(Pharmacia)部分分解100μg的DNA。用异丙醇沉淀浓缩后，进行20-5％(W/V)NaCl连续密度梯度离心，分别进行少量分级。经琼脂糖电泳确认每个级分的大小，将23-15kbp的DNA连接到λBlueSTAR载体(商品名Novagen)的XhoI位点上，用Gigapack Glod(商品名Stratagene)包装混和物制备基因组文库。用OsSUT1cDNA序列的一部分即BamHI-EcoRI片断(814bp)作为探针，根据常规方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)Molecular cloningA laboratoory manual，second ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor NY)筛选基因组文库，得到3个阳性克隆。用任意5种限制酶分别消化所述克隆，以OsSUT1cDNA序列的BamHI-EcoRI片断(814bp)作为探针，进行DNA杂交分析。其结果是，分离得到显示最强信号的EcoRI片断(4kbp)作为OsSUT1结构区域片断。当利用ABI PrismTMBigdyeTMTerminator Cycle Sequencing Kit及373ADNA Sequencer(均为Applied Biosystems；现PERKIN ELMER)确定这些碱基序列时，表明OsSUT1结构区5′端以及翻译起始点作为起点包含其上游1403bp(参照图9)。
用于研究OsSUT1启动子活性的载体的构建通过利用在两端设计含有限制酶序列的合成引物和Takara EX Taqpolymerase(商品名宝酒造株式会社)，根据PCR法扩增OsSUT1启动子区。合成引物序列如下[正向引物]1.5′-TCGGCG GCC GCGATA TCG AAT TCG CTA GGC GT-3′(下划线NotI限制位点)2.5′-AGCTCT AGAGTT GGC AGG TGC ACC ACC CTT-3′(下划线XbaI限制位点)[反向引物]3.5′-CTGGGA TCCGCC ATG GCG GAC GCG CCA CG-3′(下划线BamHI限制位点)
设翻译起始点为起点·+1时，通过上述引物1和引物3获得-1119～+14bp(1133bp)，通过上述引物2和引物3获得-315～+14bp(329bp)的2条扩增片断。用限制酶XbaI切割1133bp扩增片断，得到包含翻译起始点的-455～+14bp(496bp)片断。将这3种片断用以下所示的各接头对应的限制酶进行切割。
DNA片断11133bp片断NotI及BamHIDNA片断2469bp片断BamHIDNA片断3329bp片断XbaI及BamHI如图2所示，分别将上述3个扩增片断插入pBSII载体的该限制酶切位点上，将SmaI和EcoRI切割的GUS-NOS基因片断(来自pBI121)连接至其下游。然后，利用ABI PrismTMBigdyeTMTerminator Cycle Sequencing Kit及373A DNA Sequencer(均为Applied Biosystems；现PERKIN ELMER)解读该3种启动子序列的两端以及与GUS结构区相连的连接部分的碱基序列。其结果是，两端序列与上述基因组序列一致，证明目的序列得到扩增。而且与GUS结构区相连的连接部分没有发现移码等异常现象。
自经过重组每个DNA片断和GUS结构区而扩增的载体，得到的转录启动子控制区，包括上述DNA片断1(1133bp)，该片断自翻译起始点至1108bp上游区作为OsSUT1-promoter-1(参照图9)；上述DNA片断2(469bp)自翻译起始点至456bp上游区作为OsSUT1-promoter-2(参照图10)；上述DNA片断3(329bp)自翻译起始点至306bp上游区作为OsSUT1-promoter-3(参照图11)。
在包含DNA片断1乃至3的载体中，用限制酶NotI、HindIII切下，把启动子；GUS-NOS序列作为表达盒，并插入中间载体pSB100的该限制酶切点上。把这些载体导入到大肠杆菌系LE392，通过与农杆菌LBA4404/pSB4和大肠杆菌HB101/pRK2031的3系杂交法与引入农杆菌进行同源重组(Komari，T.等Plant J.(1996)10165-174)。
通过农杆菌法培育转基因水稻根据农杆菌法，按照Hiei，Y.等(1994)Plant J，6271-282的报道进行日本水稻“朝之光”品种转基因。将得到的转基因植物个体在空调控制的温室内(日照16个小时，白天为28℃，夜间为23℃)培育。
GUS染色植物转化后，将愈伤组织在含有潮霉素(50g/ml)的N6培养基中培养、再分化4～5个星期，将筛选得到的转化体用于GUS染色。将再分化的幼小植物个体培育至5～6片叶时，按照Kosugi，S等(Plant Science(1990)70133-140)报道的方法将叶子和根进行GUS染色。分析组织特异性表达的切片制作按照村上等(植物细胞工程学(1992)4281-286)的方法使用DTK-1000(堂阪EM)显微镜片。
通过染色分析启动子的表达(参照图2～图7)分别选出转导有OsSUT1-promoter-1～3的30个植物个体，进行GUS染色，并对该染色阳性的个体进行详细地组织特异性观察。如图2所示，水稻维管束组织内在叶片和叶鞘之间包围小的维管束的大维管束呈纵向走向，而在纵向维管束上如连接横的方向上存在着横向走向的维管束。在照片中，符号VB表示纵向维管束，符号L表示纵向维管束中的大的维管束(纵向)，而符号TV及符号T为横向维管束，符号M为纵向维管束中的小的维管束。
如图3所示，在OsSUT1-promoter-1个体里，观察到绿叶维管束韧皮部的强表达。在照片上的纵向维管束M或横向维管束T中通过其中心部的韧皮部被选择性地染色，呈现出浓淡相间图像。该现象的出现认为与OsSUT1cDNA探针的原位分析(Matsukura，C.等Plant Physiol.(2000)12485-94)的结果一致，反映出OsSUT1本身的表达。
另一方面，如图4所示，在OsSUT1-promoter-2个体里，没有观察到像OsSUT1-promoter-1个体在每个维管束韧皮部和包围韧皮部的木质部之间出现浓淡相间的情况，几乎整个维管束都被染色。也就是说，在OsSUT1-promoter-2个体里，在OsSUT1-promoter-1的5′端缺失了652bp，由此判断，虽然在绿叶和根的维管束鞘内(韧皮部、木质部、维管束薄壁细胞)看到表达，但已趋于失去韧皮部特异性的表达。
还有，在OsSUT1-promoter-3个体里，在OsSUT1-promoter-1的5′端缺失了802bp，全部呈GUS染色阳性的个体减少，如图5所示，即使在显示阳性个体中，整个叶鞘趋于染色，没有观察到维管束特异性。
另外，为了弄清发育期的特异性，将OsSUT1-promoter-1个体培养在花盆里，通过GUS染色分析开花前的表达。结果发现，OsSUT1-promoter-1在节间伸长期的节及节间的维管束韧皮部(图6)，开花期的颖片、雌蕊(柱头)、花丝、浆片的维管束(由于是显微结构，在本分析中不可能识别出韧皮部和木质部)有明显的表达(图7、8)。另外，在成熟初期，观察到了整个子房壁(开花后第3天，特别是上表皮和下表皮)、果皮维管束韧皮部(开花后10天前后)的表达(图8)。在所述部位和时期显示特异性表达的结果，与在northern印迹分析得到的结果(Hirose，T.等(1997)Plant Cell Physiol.381389-1396)相一致。
从上述结果可以得出以下结论。
(1)OsSUT1-promoter-1(-1108～-1)在维管束韧皮部具有很强的部位启动子特异活性。除了绿叶之外，在抽穗～开花～成熟期间的节或节间、花器都具有维管束韧皮部特异启动子活性和时期启动子特异活性。
(2)OsSUT1-promoter-2(-456～-1)在绿叶、根中的整个维管束鞘，包括维管束韧皮部、木质部以及维管束薄壁细胞都具有特异表达的启动子活性。在维管束中虽然维持了特异性，但因缺失-1108～-457的缺失而导致失去韧皮部的特异性。因此，预测在-1108～-457片段上存在着负责韧皮部表达的启动子序列。还有，对韧皮部特异性、时期特异性的了解不深，若利用在整个维管束鞘内具有表达的倾向，则在维管束薄壁细胞及木质部可有效地控制基因的过剩或抑制表达。(3)OsSUT1-promoter-3(-306～-1)在维管束内没有显示特异性表达，由此可以认为，司管OsSUT1表达特异性的启动子序列存在-1108～-307片段上。
利用上述启动子构建表达体系为了表达编码实际有用蛋白质的基因，可以重组编码所需蛋白质的结构基因取代上述GUS-NOS序列。在这种情况下，也可以按照本领域普通技术人员周知的技术进行如上所述的各种DNA的扩增及筛选、表达盒或表达载体的构建、基因转化及其再生等。
序列表<110>日本烟草产业株式会社(Japan Tobacco Inc.)<120>水稻蔗糖输送基因启动子<130>YCT-682<160>4<210>1<211>1440<212>DNA<213>水稻(0ryza sativa L.)<400>1tgcgcggtaa cccaccatca acctcgccgc ggctttaaat gcgccgctac agggcgcgtc 60ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 120attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 180gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag cgcgcgtaat acgactcact 240atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac ggtatcgata agcttgatat 300cgaattcgct aggcgtacac cgtgaatgat ttgatgcgtt gattacgggt attcatattc 360ctttatgaaa ggttattgtc agactttttt tattccacaa gatcgatcat actacaaagt 420tattctacaa tagtttagaa cacttatcca gttgtgttag aatataataa tgatggatgg 480atatgtatgc catattaaac aatctaaatt ccccacaaaa catataaaag aacactataa 540taaactatgg tttatccaac atggacatat atttaaatga agtgcgatct ccggtgctct 600ttactggtag gatgaatgat gatagagata aaagcgttta acaaatatgg cctcaagcga 660aattcgttat attaattaaa tcaatgaaaa catttactgg attaataaaa ctccatgcta 720ctccattata aatgaacgca cacctatata tagcaaaatt cctatttgcc agtaggtcca 780atacttcgga tctgtttttt tttcttttaa atatccaaaa ttgattttgg ataactactc 840gacagtacaa acgaattaaa ccagctatta caacgtcgag tggatttaaa acactcctct 900attaaattca cctacagaaa gtcgttcccg ctgaaataat cgcaccgtct agaagctcgg 960caagcgtgtc gctaatccga tactaactcc attaattcca ttttcatttc aataattgtt 1020gaagttatta ctgcactgga aataataaag gcaggggggt gtaactgggt gtgtacaaag 1080tgttggtgag catagcagtt ggcaggtgca ccacccttta ttatattcct cctttctctc 1140tctctctctc tctctctccc cctcttcctc cctttaaatg cttcgcctct ctcgctcgtc 1200tctccaaaca caaacccacc acctcctcct cctcctccca tccagcacgc gcctcctctc 1260tcgcgcggct ttccatttcc atctccccct cctcctccta cgtctccgcc gctcctcact 1320tcctccactc gatttccttt cttggcctct cctcctctga cacaggggtg tgcaggtttg 1380tgtttgtgcg tggcgcgtcc gccatggctc gcggcagcgg ggccggagga ggcggcggcg 1440<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>2tcggcggccg cgatatcgaa ttcgctaggc gt 32
<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>3agctctagag ttggcaggtg caccaccctt 30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>4ctgggatccg ccatggcgga cgcgccacg 29
权利要求
1.一种DNA，它具有存在于序列表SEQ ID NO1所示碱基序列中的启动子序列。
2.一种DNA，它由SEQ ID NO1自第285位上的T乃至第296位上的G到第1088位上的G乃至第1403位上的C的碱基序列组成，或者由在该碱基序列的5′末端至第953位上的A之间有部分缺失的碱基序列组成，并在植物维管束组织的韧皮部内具有特异性启动子活性；或一种DNA，它在高度严谨条件下与上述DNA杂交，并在植物维管束组织的韧皮部内具有特异性启动子活性。
3.一种DNA，它由SEQ ID NO1自第285位上的T乃至第296位上的G到第1088位上的G乃至第1403位上的C的碱基序列组成，其中有1个或数个碱基被插入、添加、缺失或取代，该DNA在植物维管束组织的韧皮部内具有特异性启动子活性。
4.一种DNA，它由SEQ ID NO1自第285位上的T乃至第296位上的G到第1088位上的G乃至第1403位上的C的碱基序列组成，在该碱基序列的5′末端至第953位上的A之间有部分缺失，其中1个或数个碱基被插入、添加、缺失或取代，该DNA在植物维管束组织的韧皮部内具有特异性启动子活性。
5.一种DNA，它由SEQ ID NO1自第953位上的A至第1403位上的C的碱基序列组成，并在植物维管束组织内具有特异性启动子活性；或一种DNA，它在高度严谨条件下与上述DNA杂交，并在植物维管束组织内具有特异性启动子活性。
6.一种DNA，它由SEQ ID NO1自第953位上的A至第1403位上的C的碱基序列组成，其中有1个或数个碱基被插入、添加、缺失或取代，该DNA在植物维管束组织内具有特异性启动子活性。
7.一种表达盒，其包括如权利要求1至6中任一项所述的DNA和在该DNA下游连接的外源基因。
8.如权利要求7所述的表达盒，其中进一步包括用于筛选基因转化体的标记基因。
9.一种用于转基因的载体，其中包括如权利要求7或8所述的表达盒。
10.一种转基因植物细胞、源自该细胞的愈伤组织、源自该愈伤组织的转基因植物或者它们的后代，其中所述转基因植物细胞是将如权利要求1至6中任一项所述的启动子DNA以及在该DNA下游将连接的外源基因重组到基因组上，并在维管束组织的韧皮部或维管束系组织中特异性表达外源基因。
11.如权利要求10所述的转基因植物细胞、源自该细胞的愈伤组织、源自该愈伤组织的转基因植物或者它们的后代，它们均为单子叶植物。
12.一种培育转基因植物的方法，其中所述植物在维管束组织的韧皮部或维管束系组织中可特异性表达外源基因，培育方法包括如下(a)提供如权利要求1至6中任一项所述的启动子；(b)在上述启动子的下游连接所需的结构基因，根据需要，再进一步在该结构基因之后连接选择标记基因，以便制备表达盒；(c)通过农杆菌法、电穿孔法、PEG法、微注射法或粒子枪法将上述的表达盒引入植物基因组中；(d)通过选择标记筛选转基因的植物细胞，进行愈伤组织培养；(e)在再生培养基中培养所述愈伤组织直到长成完整的植物体。
全文摘要
本发明提供一种具有OsSUT1基因启动子活性的DNA；并提供将该DNA用作启动子并把所需外源基因在植物维管束或其韧皮部组织内可进行特异性表达的转基因植物。在本发明中，通过水稻(Oryzasativa L.)基因组文库分离出具有OsSUT1基因启动子活性的DNA。在所述DNA中存在着能够表达序列表SEQ ID NO1所示碱基序列的韧皮部特异性以及植物发育期特异性的启动子序列。在该启动子下游连接所需外源基因并进行基因组重组，使韧皮部或维管束组织特异性表达外源基因并培育出所需的转基因植物。
文档编号C07K14/415GK1492925SQ02805219
公开日2004年4月28日 申请日期2002年1月4日 优先权日2001年1月5日
发明者山口淳二, 松仓千昭, 武田泰斗, 斗, 昭 申请人:日本烟草产业株式会社, 欣根塔有限公司