具有解酒功能厌氧菌的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有解酒功能厌氧菌的筛选方法。方法包括配制筛选用培养基；取发酵乳、泡菜等发酵食品；液体富集培养；固体培养基分离；得到初筛菌株的纯培养物；定量分析初筛菌株的解酒能力，选取性能突出的菌株即可。本发明筛选的菌株能在体内厌氧环境中迅速降解乙醇，并安全可靠。本发明方法具有简单有效、针对性强、培养周期短等优点，并且能筛选出安全高效的解酒功能菌株。
【专利说明】具有解酒功能厌氧菌的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及菌的筛选方法，尤其涉及一种功能性厌氧菌的筛选方法。
【背景技术】
[0002]酒自古以来同我国历史文化密不可分，在世界各地酒同样是倍受欢迎的饮品。适量饮酒能为身体健康带来益处，但是过量饮酒导致的醉酒不仅会对身体造成负面影响，而且酒醉往往会使人失去理智以致严重后果。因此，研制开发高效的解酒制品成为国内外共同关注的课题。
[0003]目前市场上的解酒制品多侧重化学合成药物和天然中草药，未有以活体益生菌为载体的解酒制品，解酒效果也相对比较不够理想，未能根本上减少人体对乙醇的吸收和减轻乙醇的毒害作用。
[0004]益生菌被联合国粮农组织和世界卫生组织定义为“当摄入足够的量能为宿主提供健康益处的活的微生物”。乳酸菌和双歧杆菌是最常见的益生菌类型并且不断有证据表明一些益生乳酸杆菌能提供对健康有益的作用，如抑制有害的肠道细菌和代谢产物，调节免疫功能，抑制肠道疾病，抗过敏，抑制炎症和抗癌等功效。被用于作为各种发酵乳制品和膳食补充剂的发酵剂的双歧杆菌 已经被证实了有益生和对胃的保护作用[1]。以富含益生菌的食品作为筛选对象，得到具有解酒效果的功能性益生菌株，不仅可以为开发高效的益生菌解酒产品提供基础，而且具有重要的理论价值和应用前景。
[0005]但是考虑到体内的厌氧环境，筛选条件必须为严格的厌氧条件。
[0006]综合考虑体内的厌氧环境和安全性问题，克服传统筛选方法筛选到的解酒菌株难以适应体内的厌氧环境，并且由于安全性无法直接用于人体，即使获得了菌株，其在体内对酒精的降解效能低且不稳定的缺陷，使得筛选得到的具有解酒功能厌氧菌可用于帮助人体减轻酒精的毒害作用和尽快醒酒，并能用于开发新型微生物解酒制剂。
[0007]参考文献:
[I] Gomi A, Harima-Mizusawa N, Shibahara-Sone H, et al.Effect ofBifidobacterium bifidum BF-1 on gastric protection and mucin production inan acute gastric injury rat model[J].Journal of Dairy Science, 2013， 96(2):832-837。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是为了解决现有技术筛选解酒菌存在的难以适应体内的厌氧环境并且由于安全性无法直接用于人体，对酒精的降解效能低且不稳定的问题，提供一种具有解酒功能厌氧菌的筛选方法。
[0009]具有解酒功能厌氧菌的筛选方法包括如下步骤:
1)分别配制液体富集培养基和固体筛选培养基；
2)取发酵乳、泡菜发酵食品样品5~8g ；3)将步骤2)的食品样品于步骤I)的液体富集培养基中厌氧培养5~10h，使乙醇耐受菌充分富集，得到富集培养液；
4)将固体培养基加热融化，然后冷却至45°C，迅速将ImL富集培养液与之混合，摇匀后放入厌氧培养箱中、37°C条件下培养，直至长出菌落，得到具有解酒功能厌氧菌株；
5)对具有解酒功能厌氧菌株分离纯化，并得到具有解酒功能厌氧菌株的纯培养物；
6)将具有解酒功能厌氧菌株的纯培养物接于MRS液体培养基于厌氧培养箱中、36~38°C条件下培养36~48 h，得到菌液；
7)各取200μ L菌液，以空白培养液作为参照，分光光度计下600 nm处测定样品菌液相对浓度OD6c?，根据读数用无菌水稀释菌液至相同菌液浓度IO6~IO8 cfu/mL ；
8)将稀释的菌液5mL分别与等体积5 %~80 % (v/v)乙醇迅速混合均匀，厌氧环境37°C静置0.5~1 h，进行解酒反应； 9)测定解酒反应前后乙醇浓度的变化值，比较即可得到各初筛菌株的解酒能力的定量大小，选取性能突出的菌株即可。
[0010]所述的液体富集培养基由MRS培养基添加8 % (v/v)无水乙醇，pH 6.8。所述的每升固体筛选培养基是由0.5~2 g KH2PO4、0.3~0.6 g MgSO4.7Η20、0.I~0.5 g NaCl、4~6 g(NH4)2SO4^0.01-0.02 g FeSO4.7Η20、20~25 g琼脂、8 % (v/v)无水乙醇和余量的蒸馏水组成。固体筛选培养基灭菌前的pH为7。
[0011]整个筛选过程在厌氧条件下进行。
[0012]本发明使用的固体筛选培养基中乙醇为唯一碳源，液体和固体培养基均用于厌氧状态培养微生物且两种培养基中乙醇的添加均在灭菌冷却后接种培养前进行。筛选到的解酒菌株能在体内厌氧环境高效稳定地降解乙醇，并且菌株来源为食品，故安全可靠。本发明的方法具有简单有效、针对性强、培养周期短等优点，并且能筛选出安全高效的体内解酒功能菌株。本发明的使用不仅能为新型微生物解酒制品的开发提供载体，而且为益生菌功能的研究和利用开辟了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本筛选方法实施例1定量筛选结果图。
[0014]图2为本筛选方法实施例2定量筛选结果图。
[0015]图3为基于筛选得到的性能突出菌株K4-8与H4和相类似菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树。
【具体实施方式】
[0016]下面详细说明本发明的具体实施例。
[0017]实施例1、
1)分别配制液体富集培养基和固体筛选培养基；
液体富集培养基:由MRS培养基添加8 % (v/v)无水乙醇，pH 6.8 ；
固体筛选培养基:由 2 g KH2P04、0.6 g MgSO4.7Η20、0.5 g NaCl,6 g (NH4)2SO4^0.02g FeSO4.7H20、25 g琼脂、8 % (v/v)无水乙醇和余量的蒸馏水组成，灭菌前的pH为7 ;
2)选择新疆传统发酵食品奶疙瘩作为筛选样品，取新鲜的奶疙瘩8g；3)将新鲜的奶疙瘩8g放入盛50 mL已灭菌富集培养基的三角烧瓶中，于厌氧培养箱中37°C下静置培养10 h，使样本中乙醇耐受菌充分富集，得到富集培养液；
4)将固体培养基加热融化，然后冷却至45°C，迅速将ImL富集培养液与之混合，摇匀后放入厌氧培养箱中、37°C条件下培养，直至长出菌落，得到具有解酒功能厌氧菌株；
5)对具有解酒功能厌氧菌株分离纯化，并得到具有解酒功能厌氧菌株的纯培养物；
6)配制发酵培养基及重铬酸钾-硫酸溶液；
发酵培养基=MRS培 养基，pH 6.8 ；
重铬酸钾-硫酸溶液:取重铬酸钾I g溶于25 mL水中，边搅拌边小心加入4 mL浓硫
酸；
7)挑取待测菌株的一环菌体接种于MRS液体培养基，于厌氧培养箱中、37°C条件下培养48 h，得到菌液。
[0018]8)各取200 μ L菌液，以空白培养液作为空白对照，分光光度计下600 nm处测定样品吸光度，分光光度计读数即为菌液相对浓度OD6tltl ;根据读数用无菌水稀释培养物至相同菌液浓度IO7 cfu/mL。
[0019]9)向玻璃试管中加入乙醇标准溶液0.1 mL，每个试管中加入重铬酸钾-硫酸溶液
1.0mL，充分摇匀，并盖好盖子；将试管置于沸水域中10 min，使乙醇充分挥发，并被重铬酸钾-硫酸溶液氧化；取出试管，于波长610 nm处测定重铬酸钾-硫酸溶液的吸光值；以乙醇浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作乙醇标准曲线；将待测样品的吸光值与标准曲线进行对照，即可得到样品的乙醇浓度。
[0020]10)将同一浓度的菌液5 mL分别与等体积40 % (v/v)乙醇溶液迅速混合均匀，厌氧环境37°C静置0.5 h ;然后按照4中所述的方法，测定乙醇的残留量；比较即可得到各初筛菌株的解酒能力的定量大小，选取性能突出的菌株即可。
[0021]实施例2、
1)分别配制液体富集培养基和固体筛选培养基；
液体富集培养基:由MRS培养基添加8 % (v/v)无水乙醇，pH 6.8 ；
固体筛选培养基:由 I g KH2P04、0.3 g MgS04.7Η20、0.I g NaCl、5 g (NH4)2SO4^0.01g FeSO4.7H20、25 g琼脂、8 % (v/v)无水乙醇和余量的蒸馏水组成，灭菌前的pH为7 ;
2)选择新疆传统发酵食品奶疙瘩作为筛选样品，取新鲜的奶疙瘩6g；
3)将新鲜的奶疙瘩6g放入盛50 mL已灭菌富集培养基的三角烧瓶中，于厌氧培养箱中37°C下静置培养6 h，使样本中乙醇耐受菌充分富集，得到富集培养液；
4)将固体培养基加热融化，然后冷却至45°C，迅速将ImL富集培养液与之混合，摇匀后放入厌氧培养箱中、37°C条件下培养，直至长出菌落，得到具有解酒功能厌氧菌株；
5)对具有解酒功能厌氧菌株分离纯化，并得到具有解酒功能厌氧菌株的纯培养物；
6)配制发酵培养基及重铬酸钾-硫酸溶液；
发酵培养基=MRS培养基，pH 6.8 ；
重铬酸钾-硫酸溶液:取重铬酸钾I g溶于25 mL水中，边搅拌边小心加入4 mL浓硫
酸；
7)挑取待测菌株的一环菌体接种于MRS液体培养基，于厌氧培养箱中、37°C条件下培养36 h，得到菌液。[0022]8)各取200 μ L菌液，以空白培养液作为空白对照，分光光度计下600 nm处测定样品吸光度，分光光度计读数即为菌液相对浓度OD6tltl ;根据读数用无菌水稀释培养物至相同菌液浓度IO6 cfu/mL。
[0023]9)向玻璃试管中加入乙醇标准溶液0.1 mL，每个试管中加入重铬酸钾-硫酸溶液
1.0mL，充分摇匀，并盖好盖子；将试管置于沸水域中10 min，使乙醇充分挥发，并被重铬酸钾-硫酸溶液氧化；取出试管，于波长610 nm处测定重铬酸钾-硫酸溶液的吸光值；以乙醇浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作乙醇标准曲线；将待测样品的吸光值与标准曲线进行对照，即可得到样品的乙醇浓度。
[0024]10)将同一浓度的菌液5 mL分别与等体积80 % (v/v)乙醇溶液迅速混合均匀，厌氧环境37°C静置I h ;然后按照4中所述的方法，测定乙醇的残留量；比较即可得到各初筛菌株的解酒能力的定量大小，选取性能突出的菌株即可。
[0025]实施例3、
1)分别配制液体富集培养基和固体筛选培养基；
液体富集培养基:由 MRS培养基添加8 % (v/v)无水乙醇，pH 6.8 ；
固体筛选培养基:由 0.5 g KH2P04、0.3 g MgSO4.7Η20、0.I g NaCl,4 g (NH4)2SO4^0.01g FeSO4.7H20、20 g琼脂、8 % (v/v)无水乙醇和余量的蒸馏水组成，灭菌前的pH为7 ;
2)选择韩国传统发酵食品韩国泡菜作为筛选样品，取韩国泡菜5g；
3)将韩国泡菜5g放入盛50 mL已灭菌富集培养基的三角烧瓶中，于厌氧培养箱中37°C下静置培养5 h，使样本中乙醇耐受菌充分富集，得到富集培养液；
4)将固体培养基加热融化，然后冷却至45°C，迅速将ImL富集培养液与之混合，摇匀后放入厌氧培养箱中、37°C条件下培养，直至长出菌落，得到具有解酒功能厌氧菌株；
5)对具有解酒功能厌氧菌株分离纯化，并得到具有解酒功能厌氧菌株的纯培养物；
6)配制发酵培养基及重铬酸钾-硫酸溶液；
发酵培养基=MRS培养基，pH 6.8 ；
重铬酸钾-硫酸溶液:取重铬酸钾I g溶于25 mL水中，边搅拌边小心加入4 mL浓硫
酸；
7)挑取待测菌株的一环菌体接种于MRS液体培养基，于厌氧培养箱中、37°C条件下培养36 h，得到菌液。
[0026]8)各取200 μ L菌液，以空白培养液作为空白对照，分光光度计下600 nm处测定样品吸光度，分光光度计读数即为菌液相对浓度OD6tltl ;根据读数用无菌水稀释培养物至相同菌液浓度IO6 cfu/mL。
[0027]9)向玻璃试管中加入乙醇标准溶液0.1 mL，每个试管中加入重铬酸钾-硫酸溶液
1.0mL，充分摇匀，并盖好盖子；将试管置于沸水浴中10 min，使乙醇充分挥发，并被重铬酸钾-硫酸溶液氧化；取出试管，于波长610 nm处测定重铬酸钾-硫酸溶液的吸光值；以乙醇浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制作乙醇标准曲线；将待测样品的吸光值与标准曲线进行对照，即可得到样品的乙醇浓度。
[0028]10)将同一浓度的菌液5 mL分别与等体积5 % (v/v)乙醇溶液迅速混合均匀，厌氧环境37°C静置0.5 h ;然后按照4中所述的方法，测定乙醇的残留量；比较即可得到各初筛菌株的解酒能力的定量大小，选取性能突出的菌株即可。
【权利要求】
1.一种具有解酒功能厌氧菌的筛选方法，其特征在于它包括如下步骤: 1)分别配制液体富集培养基和固体筛选培养基； 2)取发酵乳、泡菜发酵食品样品5~8g ； 3)将步骤2)的食品样品于步骤1)的液体富集培养基中厌氧培养5~10h，使乙醇耐受菌充分富集，得到富集培养液； 4)将固体培养基加热融化，然后冷却至45°C，迅速将1mL富集培养液与之混合，摇匀后放入厌氧培养箱中、37°C条件下培养，直至长出菌落，得到具有解酒功能厌氧菌株； 5)对具有解酒功能厌氧菌株分离纯化，并得到具有解酒功能厌氧菌株的纯培养物； 6)将具有解酒功能厌氧菌株的纯培养物接于MRS液体培养基于厌氧培养箱中、36~38°C条件下培养36~48 h，得到菌液； 7)各取200μ L菌液，以空白培养液作为参照，分光光度计下600 nm处测定样品菌液相对浓度OD6c?，根据读数用无菌水稀释菌液至相同菌液浓度IO6~IO8 cfu/mL ； 8)将稀释的菌液5mL分别与等体积5 %~80 % (v/v)乙醇迅速混合均匀，厌氧环境37°C静置0.5~1 h，进行解酒反应； 9)测定解酒反应前后乙 醇浓度的变化值，比较即可得到各初筛菌株的解酒能力的定量大小，选取性能突出的菌株即可。
2.根据权利要求1所述的一种具有解酒功能厌氧菌的筛选方法，其特征在于所述的液体富集培养基由MRS培养基添加8 % (v/v)无水乙醇，pH 6.8。
3.根据权利要求1所述的一种具有解酒功能厌氧菌的筛选方法，其特征在于所述的每升固体筛选培养基是由 0.5~2 g KH2PO4、0.3~0.6 g MgSO4.7Η20、0.1~0.5 g NaCl、4~6 g(NH4)2SO4^0.01-0.02 g FeSO4.7Η20、20~25 g琼脂、8 % (v/v)无水乙醇和余量的蒸馏水组成。
【文档编号】C12N1/02GK103937674SQ201410154208
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】周文文, 屠鹏程, 郑晓冬, 热米拉, 李玮, 高慧 申请人:浙江大学