一种检测hpv的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测HPV型的试剂盒，包括：1）等温扩增反应液：所述等温扩增反应液中包含RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP和NTP；2）芯片毛细管缓冲液：芯片毛细管缓冲液中包含分离缓冲液、染料和甲酰胺。同时，本发明还提供了一种用于检测HPV16型的引物对。基于核酸序列的等温扩增法结合芯片毛细管技术检测HPV时，其操作简单、快捷，扩增的特异性较高，十分适合RNA的快速、及时的检测。
【专利说明】—种检测HPV的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种检测人乳头瘤病毒(HPV)的试剂盒。
【背景技术】
[0002]人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)属于乳多空病毒科的乳头瘤病毒A属，能引起人类皮肤和黏膜组织的多种良性乳头状瘤或疣，可导致组织的异常增生，某些亚型感染还具有潜在的致癌性。分子流行病学研究说明HPV的持续感染是导致子宫颈癌的必要条件。从1976年开始发现4种HPV病毒至今，已经陆续鉴定出130多种不同的亚型，有近40种可以特异性地感染生殖器，其中20多种与宫颈肿瘤相关。根据致病力的危险程度，可将不同的亚型分为低危型HPV、高危型HPV和潜在高危型HPV，其中HPV16的致癌率最高。Richard Roden等人在2006年的研究统计表明在世界范围内，高达53.5%的宫颈癌病例与HPV16的感染息息相关。
[0003]传统宫颈癌筛查的标准是对宫颈病理组织或者脱落细胞进行细胞形态学的检查，但这一方法的灵敏度有所欠缺，特别是在诊断上皮内瘤样病变CIN2/3中存在漏检；另外，细胞形态学检测还要求操作人员有相当成熟的经验，减少发生主观误判。目前，理想的HPV特异性标志物是癌蛋白，但在实际应用中，癌蛋白的含量极低，难以实现准确快速的检测。随着基因科学的发展，HPV基因型的分析包括利用HPV的DNA和RNA进行分析，不仅能够较为精准的分析出不同的亚型，还能极大的提高分析的准确度，减少误判。因此，使用细胞学联合HPV分型检测的方法进行筛查在宫颈癌筛查过程中逐渐发展起来。目前，关于商品化的HPV基因检测主要引进国外产品，并且在国内仍处在研究阶段。
[0004]目前，一般采用RT-PCR法或核酸序列扩增法对病毒的mRNA进行的扩增检测。虽然此方法在国外已经开发出相关检测方法和仪器，但是该方法需要高精密度的仪器和复杂的实验操作过程，价格较高，不利于在广大欠发达地区推广普及应用。
[0005]因此，针对目前流行病学统计中易感HPV的mRNA开发一种经济实用的HPV的基因检测试剂盒，能够结合细胞形态学的检查对宫颈癌及其癌前病变进行筛查，具有很重要的现实意义。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种检测HPV的试剂盒，其特征在于，包括如下组分，
[0007]I)等温扩增反应液:所述等温扩增反应液中包含RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP和NTP ；
[0008]2)芯片毛 细管电泳缓冲液:所述芯片毛细管电泳缓冲液中包含分离缓冲液、染料和甲酰胺。
[0009]其中，RNA反转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA (cDNA)的酶；RNA聚合酶是以一条DNA链或RNA链为模板、以三磷酸核糖核苷酸为底物、通过形成磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶；RNA酶H是一种能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链，但不能消化单链或双链DNA和独立的RNA的核糖核酸内切酶。
[0010]在一个具体实施例中，所述引物选自用于检测HPV16型的引物，且所述引物的序列为如上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID N0:2所示的序列。
[0011]在一个具体实施例中，所述RNA反转录酶选自AMV反转录酶，RNA聚合酶选自T7RNA聚合酶。
[0012]在一个具体实施例中，在组分I)的等温扩增反应液中，所述RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP、NTP和DMSO可以任意组合为一种或多种溶液；但优选地为RNA反转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H组合为一种溶液E-1，而组分I)中其余成份组合成另一种溶液S-1I。
[0013]在一个具体实施例中，组分2)的芯片毛细管电泳缓冲液可以任意组合为一种或多种溶液，但优选地组合为一种溶液B-1II。
[0014]在本发明中，将各种溶液在反应体系中的使用浓度分别定义为IX，举例来说，如果AMV在反应体系中的使用浓度为0.24U/ μ 1，则该浓度定义为I X，那么在试剂盒中的浓度如果为IOX，其实际浓度为2.4U/y I ;再如，如果Tris在反应体系中的使用浓度为40mM，则该浓度定义为IX，那么在试剂盒中的浓度如果为25 X，其实际浓度为1M。
[0015]因此，在一个具体实施例中，所述E-1在试剂盒中的浓度选自IOX:2.4U/y I RNA反转录酶，20.ου/μ I RNA聚合酶，0.08U/μ I RNA酶H ;所述S-1I在试剂盒中的浓度选自 IOX:400mM 的 Tris (pH8.5)、120mM 的 MgCl2、700mM 的 KCl、50mM 的二硫苏糖醇、IOmM 的dNTP、20mM的NTP,2.0 μ M的上游引物、2.0 μ M的下游引物；所述B-1II在试剂盒中的浓度选自I X:79%(v/v)的分离缓冲液(含2%羟乙基纤维素的TBE溶液)，20%(v/v)的甲酰胺和1%(v/v)的荧光染料SYBR Gold稀释液(其中，所述SYBR Gold稀释液是由SYBR Gold稀释100倍得到的)组成的芯片毛细管电泳缓冲液。
[0016]在一个具体实施例中，所述RNA酶H、RNA反转录酶和RNA聚合酶的组合比例为1-6:50-100:350-600 ;优选地其比例为 2:60:500，即 1:30:250。
[0017]在一个具体实施例中，还包括内标,所述内标选自如SEQ ID N0:3所示的序列；且内标的上游引物序列为SEQ ID N0:4所示的序列，下游引物序列为SEQ ID N0:5所示的序列。
[0018]在一个具体实施例中，所述试剂盒中还包括HPV阳性对照和HPV阴性对照。
[0019]在另一个具体实施例中，所述RNA反转录酶的浓度选自10-100 X ;RNA聚合酶浓度选自10-100X ;RNA酶H浓度选自10-100X ;所述扩增反应缓冲液选自2_50XTris，pH=8.0-9.0 ;所述金属离子溶液选自5-100X的MgCl2和5-100X的KCl ;还原剂溶液选自10-200X的二硫苏糖醇或巯基乙醇；dNTP的浓度选自10-100X ；NTP的浓度选自10-100X。
[0020]在一个具体实施例中，组分I)的等温扩增反应液中还包括DMS0,优选其在组分I)中不与其他成份形成混合液。
[0021]本发明还提供一种用于检测HPV16型的引物对，其特征在于，其序列为如SEQ IDN0:1和SEQ ID N0:2所示的序列。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为实施例1的HPV16的检测流程图；
[0023]图2为实施例1的响应曲面法对等温扩增过程进行条件优化的结果；
[0024]图3为实施例2中得到的总mRNA的芯片毛细管电泳(MCE)检测结果；
[0025]图4为实施例2的空白实验和经等温扩增法(NASBA)扩增后产物HPV16的反义mRNA的MCE定性检测结果，其中，峰a为引物峰，峰b为产物峰；
[0026]图5为实施例3的HPV16反义mRNA的MCE半定量检测，其中，峰a为引物峰，峰b为产物峰。
【具体实施方式】
[0027]本试剂盒米用等温扩增法(Nucleicacid sequence-based amplification,NASBA)结合芯片毛细管电泳(Microchip capillary electrophoresis,MCE)检测技术对样品检测。
[0028]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。但本发明并不仅限于下述实施例。所述实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0029]实施例1 [0030]本实施例为试剂盒的开发过程以及所得的试剂盒。
[0031]HPV的具体检测流程为(见图1):在获得待检测的宫颈细胞样品后，进行mRNA的提取，之后以获得的RNA为模板，在等温扩增反应液的作用下，在一定的温度下(如44°C)进行等温扩增，扩增结束后，对所扩增的样品进行芯片毛细管电泳检测。
[0032]其中，试剂盒中的具体组分为:1)等温扩增反应液:所述等温扩增反应液中包含RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP、NTP和DMSO ；2)芯片毛细管电泳缓冲液:所述芯片毛细管电泳缓冲液中包含分离缓冲液、染料和甲酰胺。
[0033]为了获得最优的等温扩增条件:本发明采用了响应曲面法对等温扩增过程进行条件优化。即利用Design-Expert软件进行响应曲面法试验,建立连续变量曲面模型如图2,确定最佳等温扩增条件。对影响等温扩增过程的AMV反转录酶、T7RNA聚合酶、等温扩增温度、扩增时长四个因素进行考察，各因素的考察低值分别为6U、30U、38°C、60min,各因素的考察高值分别为10U、50U、44°C、180min ;将芯片毛细管电泳检测扩增产物产生信号的强度作为因变量。拟合因素和因变量之间的函数关系，得到最佳等温扩增条件。
[0034]优化之后，等温扩增过程中的具体使用浓度为:40mM的Tris(pH8.5)、12mM的MgCl2,70mM 的 KCl、5mM 的二硫苏糖醇、ImM 的 dNTP、2mM 的 NTP、15% 的二甲基亚砜(DMS0)、
0.2 μ M的上游引物、0.2 μ M的下游引物和DEPC处理过的无RNA酶的水，在25ul的反应总体系中，酶的用量为50U的T7RNA聚合酶、6U的AMV反转录酶和0.2U的核糖核酸酶H，再加入2 μ I (约IOOng)的RNA模版。
[0035]为了使本试剂盒的使用更加方便，同时能够使各溶液组分更稳定的保存，发明人经过大量的优化实验，通过调整各组分的比例、浓度等参数，得到一组最优化的组合溶液，即在等温扩增反应液中将三种酶溶液组合为一种溶液Ε-Ι，将引物、扩增反应缓冲液、金属离子缓冲液、还原剂缓冲液、dNTP和NTP组合为一种溶液S-1I ;芯片毛细管电泳缓冲液组合为一种溶液B-1II。将各种溶液在反应体系中的使用浓度分别定义为IX，那么，
[0036]10ΧΕ-Ι*:2.4υ/μ1 RNA 反转录酶，20.0U/μ I RNA聚合酶，0.08U/μ I RNA酶H。
[0037]10XS-1I 为:400mM 的 Tris(pH8.5)、120mM 的 MgCl2、700mM 的 KCl、50mM 的二硫苏糖醇、IOmM的dNTP、20mM的NTP、2.0 μ M的上游引物、2.0 μ M的下游引物。
[0038]IXB-1I1:79%(v/v)2%羟乙基纤维素、20%(v/v)的甲酰胺和1%(v/v)的荧光染料SYBR Gold稀释液组成的芯片毛细管电泳缓冲液。
[0039]具体的，本试剂盒提供的用于扩增HPV的引物为一种HPV16的引物对，其上游引物为 5’ -ACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCA-3’；下游引物为 5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCTCCTCCTCTGAGCTGTCATTTAA-3’。
[0040]显而易见的，本试剂盒可以通过改变HPV的特异引物来检测HPV的其他亚型。
[0041]持家基因作为维持细胞基本生命活动所必需的要素,在所有细胞中均有表达；持家基因表达水平受环境因素影响较小，在细胞生长各阶段都有持续表达，一般变化很小。由于持家基因具有高度保守并且在大多数情况下持续稳定表达这一特性，所以经常被选作PCR, RT-PCR的内参，β -actin作为一种常见的持家基因，经常会被选作内部参照。
[0042]因此，试剂盒中还可以包括HPV的内标:具体的，本发明选用序列号为mRNA6988 (NCBI参照序列:NM_001101.3)的持豕基因作为内标，内标的上游引物序列为:TGACGTGGACATCCGCAAAG，下游引物序列为:AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGAAGGTGGACAGCGAGG，扩增之后得到的扩增产物为205nt (nt939_1143)。
[0043]此外，试剂盒中还可以包括HPV的阳性对照=CaSki细胞(即感染HPV16的阳性细胞)，和HPV的阴性对照=HUVEC细胞。
[0044]实施例2
[0045]本实施例为实施例1中的试剂盒定性检测的应用。
[0046]I)细胞样品的总mRNA的提取:获取一定量的待测宫颈细胞后(<107)，加入1ml裂解液，震荡后静置3min ;加入0.2ml氯仿,混匀后冰上静置15min, 16000rpm离心5min ;将不多于80%的上层清液移入新的离心管，加入0.2ml乙醇，震荡后，将溶液过硅胶柱；将柱子清洗4次后，用DEPC处理的无菌水洗脱，即可得到高纯度RNA ;总RNA提取完成，进行MCE检测后(见图3 )，从图3中可以看出，提取的总mRNA中的18S和28S峰值明显，信噪比高，质量达到了后续实验的要求，可立即进行后续实验，也可以将其保存在_70°C冰箱备用。
[0047]由于RNA易于降解，采用操作简便、耗时短的RNA提取纯化过程更有利于实验的顺利进行。而总RNA提取纯化一体化方法过程简单、耗时较短，仅在一小时内就能完成，恰恰能够很好的契合上述要求，从而保障了在提取过程中能够较大程度的保持RNA的完整性。同时，由于本提取方法结合了硅胶柱纯化技术，可快速便捷的获得高纯度的RNA。此外，由于提纯后的RNA保存在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的无RNA酶的无菌水中，因此不易对后续实验操作产生影响，有利于提高实验效率。
[0048]2)总mRNA的等温扩增:在本次操作中，具体为25ul的反应总体系，在反应总体系中加入2 μ I的步骤I)中获取的RNA模版，并加入用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP、NTP和DMS0，将反应体系混匀，短暂离心后，放入干式恒温浴或者恒温水浴中65°C 5min,而后41°C 5min。
[0049]以上步骤完成后，迅速加入酶溶液，即50U的T7RNA聚合酶、6U的AMV反转录酶和0.2U的核糖核酸酶H。
[0050]将上述反应体系混匀，短暂离心后，继续放入干式恒温浴或者恒温水浴中440C 2.0h，从而得到168nt的扩增反应产物，反应结束后放入冰上终止反应，若不立即进行检测，贮存于_70°C备用。
[0051]本发明基于核酸序列的NASBA法不需要热变性、长时间温度循环等过程；NASBA扩增效率高，扩增时间短；特定引物和特定聚合酶的使用，提高了扩增的特异性较高。总的来说，等温扩增法操作简单，可以不需要特殊的仪器，只要能达到所需恒温的效果即可；同时，该方法极大的降低了样品中DNA、蛋白、白蛋白和脂质等的影响。
[0052]3)扩增样品的MCE定性检测:在对NASBA扩增产物进行芯片毛细管电泳检测前，首先对扩增产物进行热变性，以减少体系内存在的二级结构RNA对检测结果的影响，具体实施过程如下:将扩增产物在干式恒温浴或者恒温水浴中65°C下放置5min，然后冷却至室温即可。按照待测样品的数量配制IX的含2%羟乙基纤维素的TBE溶液作为分离缓冲液，芯片毛细管电泳缓冲液中的分离缓冲液:染料:甲酰胺的体积配比为79:1:20。样品变性完成后，用芯片毛细管电泳仪进行，结果如图4所示，图4中曲线I为待测样本呈阴性的结果图，而曲线2为待测样本呈阳性的结果图。从图4中可以看出，扩增的目标片段峰值明显，信噪比高，特异性强，达到了检测快速、及时的目的。
[0053]本发明中，在得到等温扩增产物后，无需经过复杂处理，即可进行MCE的检测，检测结果在几分钟内就能获得。与其它检测方法如原位杂交、分子信标等相比，本方法快捷、简单易操作，十分适合 RNA的快速、及时的检测。
[0054]实施例3
[0055]本实施例为实施例1中的试剂盒的半定量检测的应用。
[0056]在对待测样本进行半定量检测前，先使用本发明中的方法和使用标准浓度的CaSki细胞得到如图5所示的用于半定量对比的谱图。其中，图5中从上至下的五条曲线依次为CaSki细胞个数在102、103、IO4UO5和O个时的MCE检测结果。其中，细胞个数计算根据细胞计数仪获得细胞的浓度，然后根据所述浓度乘以所用的体积获得总的细胞个数。从图5中可见，当CaSki细胞在IO4和IO5时，可以明显的检测到目标片段的峰值信号，此时信噪比高，特异性强。利用图5所得的结果，与待测样本的MCE检测结果进行比较，可以对待测样本宫颈细胞进行快速、及时的半定量检测。
【权利要求】
1.一种检测HPV的试剂盒，其特征在于，包括如下组分， O等温扩增反应液:所述等温扩增反应液中包含RNA反转录酶、RNA聚合酶、RNA酶H、用于扩增HPV的引物、扩增反应缓冲液、金属离子溶液、还原剂溶液、dNTP和NTP ； 2)芯片毛细管电泳缓冲液:所述芯片毛细管电泳缓冲液中包含分离缓冲液、染料和甲酰胺。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物选自用于检测HPV16型的引物,且所述引物的序列为如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的序列。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA反转录酶选自AMV反转录酶，RNA聚合酶选自T7RNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在组分I)的等温扩增反应液中，RNA反转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H组合成一种溶液，而组分I)中其余成份组合成另一种溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，在组分2)中的芯片毛细管电泳缓冲液组合为一种溶液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA酶H、RNA反转录酶和RNA聚合酶的酶活单位的比例为1-6:50-100:350-600，优选其比例为2:60:500。
7.根据权利要求 1-5中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括内标，所述内标序列选自如SEQ ID NO:3所示的序列，且内标的引物序列为如SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示的序列。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，组分I)的等温扩增反应液中还包括DMSO，优选其在组分I)中不与其他成份形成混合液。
9.一种用于检测HPV16型的引物对，其特征在于，其序列为如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103898241SQ201410154175
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月17日 优先权日:2014年4月17日
【发明者】林金明, 林雪霞, 刘全利, 李海芳 申请人:清华大学