一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用。该高抗逆性拜氏梭菌株基因Cbei_3304不能正常表达，缺失正常的Cbei_3304蛋白功能，对毒素物质阿魏酸、香草酸等具有高抗逆性，对未脱毒木质纤维酸解糖液中的毒素物质也具有高度抗逆性，能非常好地发酵生产丁醇；本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌抗逆性的方法，只需使拜氏梭菌缺失正常的Cbei_3304蛋白功能即可获得对未脱毒木质纤维酸解糖液中的毒素物质具有高度抗逆性，且可高效生成丁醇的拜氏梭菌，有利于推广对木质纤维资源的高效利用。
【专利说明】一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用，属于基因工程和发酵工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着化石能源的日益枯竭，利用可再生的木质纤维质原料(如玉米芯、甘蔗渣等)通过微生物发酵法生产生物能源和生物基化学品，成为研究的重点和热点之一。木质纤维原料必须经过预处理，得到微生物可发酵的糖，才能被微生物很好的利用。然而，木质纤维原料经预处理后，会产生有机酸、糠醛、酚类等抑制物，这些抑制物的除去成本较高、并对微生物生长有一定的抑制作用。因此，提高微生物的抗逆性尤其重要。
[0003]丁醇具有能量密度大、可与汽油任意比混合、可直接用于内燃机等优点，丁醇作为新型可再生的液体能源，受到广泛的重视。利用木质纤维原料发酵制备燃料丁醇，成为研究的热点之一。Thaddeus Ezeji 等(Bioresource Technol.2008, 99: 5915-5922)利用拜氏梭菌突变株BA101，以XAD-4 resin脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底物发酵，总溶剂产量为9.30 g/L;但突变株BAlOl不能利用未脱毒的酸解糖液发酵产丁醇。中国专利ZL 201110020102.6报道:通过粒子束诱变育种得到的拜氏梭菌beijerinckii ) IB4对酹类化合物具有较高的抗逆性,其能以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为碳源，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 10.3g/L和7.1 g/L。然而，郭亭等(J and Microbio l Biotechnol., 2012, 39(3)，401-407)研究发现，当玉米芯和甘鹿洛酸解糖液中的酹类化合物的浓度提升到1.5 g/L以上时,拜氏梭菌
办eij'erifldii) IB4 基本不生长。Tomas 等(Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8):4951 -4965)在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋白的^roESL基因，使丁醇对菌体细胞的抑制作用降低了 85%,并最终使产物浓度提高了 33%。Thaddeus Ezeji等(BiotechnolBioeng 2007，97 (6): 1460-1469)研究发现有机酸、糠醛等不影响丁醇的发酵，而酚类抑制物对丁醇发酵有明显的抑制效应。然而，酚类化合物对微生物生长与发酵的抑制机制比较复杂，其抑制机理还不清晰。
[0004]基于此，木质纤维预处理后的毒素抑制物(如阿魏酸、香兰酥等)严重抑制拜氏梭菌的生长和发酵性能；提高拜氏梭菌对酚类化合物等毒素的抗逆性，是木质纤维原料制备燃料丁醇产业化必须解决的关键问题之一。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供一种容易获得的高抗逆性拜氏梭菌，其对酚类化合物等毒素具有高抗逆性。
[0006]本发明的目的在于提供一种高抗逆性拜氏梭菌。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种高抗逆性拜氏梭菌的构建方法。
[0008]本发明的再一目的在于提供一种高抗逆性拜氏梭菌的应用。[0009]本发明所采取的技术方案是:
一种高抗逆性拜氏梭菌，其缺失正常的Cbei_3304蛋白功能。
[0010]进一步的，上述高抗逆性拜氏梭菌，其基因Cbei_3304不能正常表达。
[0011]进一步的，上述高抗逆性拜氏梭菌，其基因Cbei_3304被插入失活。
[0012]上述一种高抗逆性拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用。
[0013]进一步的，上述应用具体为:高抗逆性拜氏梭菌以不脱毒的木质纤维酸解糖液为原料直接发酵制备丁醇。
[0014]本发明的有益效果是:
本发明将拜氏梭菌中编码膜蛋白的Cbei_3304基因进行插入失活后，使得此基因不能正常表达，获得Cbei_3304基因插入失活的重组菌株。本发明提供了一种简单、高效的提高拜氏梭菌抗逆性的方法，借助此方法得到的重组菌株对毒素物质(阿魏酸、香草酸等)具有较高抗逆性，当以未脱毒的甘蔗渣酸解糖液为碳源时，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 7.0 g/L和5.1 g/L，而同等条件培养的出发菌株基本不生长。利用本发明方法构建的重组菌株，其抗逆性强、丁醇产量高，是一种适用于甘蔗渣等木质纤维原料发酵生产丁醇的优良菌种。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明插入失活载体pWJ的质粒图谱；
图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图；
图3为转化子菌落PCR电泳图。
【具体实施方式】
[0016]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0017]实施例1
一、拜氏梭菌Cbei_3304基因插入失活突变株的构建
构建拜氏梭菌Cbei_3304基因插入失活突变株的原理如图2所示，具体构建过程包括以下步骤:
(I)Cbei_3304插入失活载体的构建
I)设计内含子
根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的Cbei_3304基因序列(如SEQ ID No:l所示)，借助软件设计合适的插入基因位点(http://www.clostron.com),选择插入在第101-102个碱基之间，并生成内含子序列,合成内含子序列S-101 (其序列如SEQ ID N0:2所示)，并设计以下引物。
[0018]克隆引物:
pffJ-0SC-101-S:59 - ggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttacacttcgcc -3’，其序列如 SEQ ID NO:3 所示；
pffJ-0SC-101-A:5，-ggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataag-3，,其序列如SEQ ID NO:4 所示。
[0019]验证引物:
Cbe1-3304-T-S:5，-taaattacctacagcaaaactgtg-3，，序列如 SEQ ID NO:5 所不；
Cbe1-3304-T-A:5，-ggaattaagaaccttgaatctatc-3，，序列如 SEQ ID NO:6 所不。
[0020]引物pWJ-0SC-101-S引入Xho I酶切位点(下划线部分)，引物pWJ-OSC-lOl-A引入BsrG I酶切位点(下划线部分)。
[0021]2) Cbei_3304-pffJ-101 重组载体构建
用Xho I和BsrG I双酶切载体pWJ，pWJ质粒图谱如图1所示，其序列如SEQ IDNO:7所示。酶切产物经纯化试剂盒(Takara)纯化后，与内含子序列S-1Ol通过一步克隆(ClonExpress)连接。将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌E.co/i DH5a,涂布到含有50μ g/ml氨苄霉素抗性LB平板，37°C培养12~16h，挑取转化子，接到液体含有50 μ g/ml氨苄霉素LB培养基中，37°C、200rpm培养12h，提取重组质粒(AXYGEN)，测序验证，获得Cbei_3304-pffJ-101 重组载体。
[0022]3) Cbei_3304-pffJ-101 重组载体的甲基化
制备E.coli Top 10/pAN2的化学感受态，将测序成功的Cbei_3304-pWJ_101重组载体转化到大肠杆菌E.co7i Top 10，由于pAN2质粒具有四环素抗性，故涂布到含有SOμg/ml氨苄霉素和IOy g/ml四环素双抗性LB平板，37°C培养12~16h，挑取转化子，接到液体含有50μg/ml氨苄霉素和10Pg/ml四环素LB培养基中，37°C、200rpm培养12h，提取甲基化的Cbei_3304-pWJ-101重组载体(pAN2质粒含有一个枯草芽孢杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)，即Cbei_3304插入失活载体。
[0023](2) Cbei_3304 插入失活载体转化拜氏梭菌{Clostridium beijerinckiiNCIMB8052)
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 接种至 CGM 培养基(酵母粉 3 g/L，蛋白胨 5 g/L，可溶性淀粉 10 g/L，乙酸铵 2 g/L, NaCl 2 g/L, MgSO4.7H20 3 g/L, KH2PO4I g/L, K2HPO4 I g/L，FeSO4.7Η20 0.1 g/L) 37°C过夜培养，次日以 5% 比例接种到 CGM 培养基，37°C培养6-8h，以10%接种到2XYTG培养基(酵母粉16 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠 5 g/L)37°C培养 3h，0D6QQnm=l ;
2)取50ml拜氏梭菌菌液，5000rpm，4°C离心10min，弃上清。在以ETM缓冲液(270mM蔗糖，0.6mM Na2HPO4,4.4mM Na2HPO4, IOmM MgCl2)重悬；同上离心，去上清，再次以ETM缓冲液重悬，同上离心，彻底取上清；
3)以Iml ET 缓冲液(270mM 蔗糖，0.6mM Na2HPO4,4.4mM NaH2PO4 重悬，取 200μ1，加入lug Cbei_3304插入失活载体,加入0.2cm预冷的电转杯,轻轻混匀；
4)使用MicroPulserTM电转仪电转，条件为电压1.8kV,电阻200 Ω，电容2.5μΡ,电击后立刻加入ImL 2XYTG培养基，转移到无菌离心管中复苏2~3h ;
5)取200μ1上述菌液，涂布到含有10μδ/πι1红霉素的CGM固体培养基，培养2~3天。
[0024](3)Cbei_3304插入失活突变株的筛选
挑取上述步骤5)中培养2~3天的转化子，使用引物Cbe1-3304-T-S和Cbe1-3304-T-A对转化子进行菌落PCR验证，筛选出内含子插入基因组的突变株(插入后，PCR扩增出基因条带电泳图上比野生型大约lKbp)，如图3所示，将正确插入的突变株传代三次，同时涂布在含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的CGM固体培养基上，筛选出敲除质粒丢失的突变株(在红霉素抗性平板上不能生长的突变株)。
[0025]二、Cbei_3304插入失活突变株的传代稳定性
将上述构建的Cbei_3304基因插入失活的拜氏梭菌突变株在固体培养基上连续转接7次，发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特征上相同，生长状态良好。在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测重组菌的传代稳定性，插入失活突变菌传代发酵试验结果如表1所示。
[0026]表1不同传代次数的Cbei_3304插入失活突变菌的发酵情况
【权利要求】
1.一种高抗逆性拜氏梭菌，其特征在于:其缺失正常的Cbei_3304蛋白功能。
2.根据权利要求1所述的一种高抗逆性拜氏梭菌，其特征在于:其基因Cbei_3304不能正常表达。
3.根据权利要求2所述的一种高抗逆性拜氏梭菌，其特征在于:其基因Cbei_3304被插入失活。
4.权利要求1~3中任一所述一种高抗逆性拜氏梭菌在发酵制备丁醇中的应用。
5.根据权利要求4所述的 应用，其特征在于:权利要求1所述的高抗逆性拜氏梭菌以不脱毒的木质纤维酸解糖液为原料直接发酵制备丁醇。
【文档编号】C12N1/20GK103911334SQ201410153818
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】郭亭, 梁达奉, 张九花, 蚁细苗, 谭文兴, 黄玉南, 李雨虹, 钟映萍 申请人:广州甘蔗糖业研究所