专利名称：球孢白僵菌菌核的培养方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及虫生真菌菌核的培养方法及其在防治害虫方面的应用。
背景技术：
西花蓟马 Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera Thripidae) 是世界性的多种经济作物上的一种重要害虫。西花蓟马通过锉吸取食和传播植物病毒对作物造成严重为害。西花蓟马的生活史包括地上取食阶段(成虫，1龄和2龄若虫)和土栖阶段O龄若虫末期，预蛹和蛹)。大部分西花蓟马的老熟2龄若虫都表现出正趋地性和负趋光性，从植物上转移到土壤或盆栽介质中化蛹。依据寄主植物种类的不同，最多有98%的蓟马在地下化蛹，并分布在1.5 2. Ocm深的土层中，直到发育为成虫后从土壤中羽化出来再转移到地上为害。此外，由于反复频繁地施用化学药剂，该虫已发展出对多种化学杀虫剂具抗性的种群。土壤中施用虫生真菌是有效治理蓟马土栖阶段的有效措施。球孢白僵菌 (Beauveria bassiana(Balsamo)Vuillemin,以下简称白僵菌)是寄主谱广泛的重要昆虫病原真菌之一，许多商用或非商用的白僵菌菌株均能引起西花蓟马的高度侵染。用虫生真菌防治地下害虫的商用兴趣促进了相应剂型的发展。这些剂型的基础是液相培养产生的菌丝或者是在营养或非营养载体上固相培养产生的分生孢子。这些菌丝或分生孢子通常是干旱耐受性差以及货架寿命较短，从而限制了它们的实际应用。为了在土壤和腐败的植物材料中存活，许多植物病原真菌产生菌核，即紧密的菌丝聚集体，并以这些繁殖体作为越冬结构。一些植物病原真菌，例如大豆炭疽病菌 Colletotrichum truncatum (Schweinitz)禾口大豆褐红坏死病菌 Mycoleptodiscus terrestris(Gerd.)在深层液体培养发酵中，能够产生微菌核(microsclerotia，MS)，即直径200 600 μ m的菌核颗粒。作为真菌除草剂，这些杂草病原物的MS是土壤和水生环境中有持效侵染性的繁殖体。然而，到目前为止还没有对防治西花蓟马土栖阶段重要病原真菌-白僵菌MS培养与应用的报道。以昆虫病原真菌菌核防治西花蓟马等害虫，可以简化抗虫制剂的生产工艺，降低成本，并对环境没有污染，因此，具有广阔的应用前景。
发明内容
针对分生孢子作为昆虫病原真菌杀虫剂的繁殖体存在的缺陷，本发明提供了一种液体培养虫生真菌菌核的技术，所述虫生真菌优选为球孢白僵菌。本发明所提供的虫生真菌菌核的液体培养方法，需要将液体培养成分和培养条件控制在一定的范围内。培养出的菌核经过真空干燥后，可以长期贮藏，在适宜的条件下仍然能萌发出菌丝和有致病力的分生孢子，该技术成本低，菌核贮藏期长，非常适合推广普及。本发明的目的通过下述技术方案来实现—种虫生真菌菌核的培养方法，其特征是包括以下步骤1) 一级平板培养；2)孢子悬浮液的制备；幻液体培养菌核；4)菌核的干燥。所述虫生真菌包括任何昆虫病原真菌，优选为球孢白僵菌。所述一级平板培养是真菌菌株在PDA培养基上培养待其产生孢子，将产生孢子的切成琼脂块，于甘油中超低温保存备用。培养时可在常规的真菌培养条件下进行，如于室温下( 22°C )在PDA培养基上培养3周，将产生孢子的琼脂平板切成Imm2的琼脂块，浸没在10%甘油中于-80°C下保存。所述孢子悬浮液的制备是将冷冻贮藏的琼脂块接种到PDA平板上，在室温( 220C )下培养2 3周，加入含有0. 1 %的聚乙二醇油酸基化合物(吐温-80)的无菌水，无菌操作打散混勻、稀释，制成孢子悬浮液(终浓度为LOXlO9L-1)备用。所述液体培养菌核是将步骤2、制备的孢子悬浮液接入培养液中(使孢子终浓度达到5 X IO6L-1)，放置于恒温摇床中培养。培养条件为温度2248°C，摇速^0-300rpm ；优选为培养温度25°C，摇速300rpm。所述菌核的干燥是将步骤3)的培养液中加入硅藻土(DE)，使浓度达到 5gDE/100mL培养液，将MS-DE混合物抽滤到预称重的滤纸上，从滤纸上分离下来，用冷冻干燥机真空干燥至含水量< 5%时，冷冻密封，并于4°C贮存。上述菌核培养过程中所用的PDA培养基为常用的微生物培养基，其成分和含量均是公知的，可通过教科书或实验手册查得。液体培养菌核时所用的培养液组成包括基础盐(g·!/1)，微量元素(yg·!/1)，复合维生素Bhg·!/1)，氮源(g.L-1)，碳源(g.L-1)和吐温-80 (ν/ν)；其中，所述的基础盐 (g · I/1)选自=KH2PO4 0. 5-2. 0、MgS04 · 7H20 0. 5-2. 5 或 CaCl2 · 2H20 0. 01-0. 05 ；所述的微量元素(μ g · L-1)选自=H3BO3 5-30、MnSO4 · 4H20 10-50、CuSO4 · 5H20 50-80、ZnSO4 · 7H20 50-400或佝(13 · 6H20 20-500 ；所述的复合维生素B ( μ g · L-1)选自硫胺5-30、核黄素 2-15、吡哆胺0. 5-2或右旋泛酸钙2-10;所述氮源(g · L-1)选自大豆粉5_15或玉米粉， 5-15;所述的碳源(g.L—1)是葡萄糖，5-25 ；所述的吐温-80 (ν/ν)为0. 2-0.8% ；培养液的最终PH调至5. 5-7. 1。优选为其中所述的基础盐(g · L—1)选自=KH2PO4 1. 5, MgSO4 · 7H20 0. 5 或 CaCl2 · 2H20 0. 01 ；所述的微量元素(μ g · Γ1)选自=H3BO3 30、MnSO4 · 4Η20 40、 CuSO4 · 5Η20 80、ZnSO4 · 7Η20400 或 FeCl3 · 6Η20 500 ；所述的复合维生素 B ( μ g · Γ1)选自 硫胺30、核黄素15、吡哆胺2或右旋泛酸钙10 ；所述的氮源(g -Γ1)选自大豆粉15或玉米粉15;所述的碳源(g·!/1)为葡萄糖25 ；所述的吐温-80 (ν/ν)为0.4-0. 8% ；培养液的最终PH调至6. 8。本发明还涉及通过上述培养方法获得的虫生真菌菌核在制备防治害虫的生防制剂中的应用，所述虫生真菌优选球孢白僵菌，所述害虫优选西花蓟马。本发明还进一步涉及一种防治害虫的生防制剂，其特征在于，包括通过上述培养方法获得的虫生真菌菌核和辅料。所述虫生真菌菌核优选球孢白僵菌菌核，所述害虫优选西花蓟马；所述辅料是抗虫制剂制备领域常用的辅助试剂，本领域的技术人员完全可以根据制剂的类型选择相应的辅料类型。本发明所用的真菌菌株和虫源，如球孢白僵菌和西花蓟马，均属于公知公用的实验材料，可通过常规的途径获得，如商业途径购买等。例如，实施例中所用的球孢白僵菌购自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。
本发明首次用液体深层发酵法能产生虫生真菌菌核。干燥制备的微菌核能够保持活力，复水后能够萌发出菌丝和孢子，增加了上述真菌作为西花蓟马土栖阶段防治因子的潜力。该生产过程工艺简单，成本低廉，生产过程中无污染性废料产生，十分环保。用该方法获得的虫生真菌防治西花蓟马等害虫，可以减少化学农药对植物和环境的污染，对人和动物没有伤害，因此，本发明具有广阔的应用前景。
图1在摇床上液体深层培养时球孢白僵菌菌核的发育。在(A) 24小时后接入的分生孢子开始形成勻质的菌丝。随着培养时间的增加，菌丝开始聚集形成菌核；(B)Day 2 ； (C)Day 4 ； (D)Day 6。
具体实施例方式本发明所用的真菌菌株和虫源，如球孢白僵菌和西花蓟马，均属于公知公用的实验材料，可通过常规的途径获得，如商业途径购买等。例如，实施例中所用的球孢白僵菌购自中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。实施例1球孢白僵菌菌核的培养1.培养方法1. 1 一级平板菌种培养将球孢白僵菌菌株于室温下( 22°C)在PDA培养基上培养3周。将产生孢子的琼脂平板切成Imm2的琼脂块，浸没在10%甘油中于-80°C下保存。1. 2孢子悬浮液的制备液体培养时，将冷冻贮藏的琼脂块接种到PDA平板上，在室温( 22°C )下培养 2 3周。加入含有0. 的聚乙二醇油酸基化合物(吐温-80，Sigma)的无菌水，无菌操作打散混勻、稀释，制成终浓度为1. OX IO9L-1的孢子悬浮液备用。1. 3液体培养菌核在250mL烧杯中，装入IOOmL培养液，接入孢子悬浮液，使孢子终浓度达到 5X ΙΟ6!/1，放置于恒温摇床(温度25°C ；摇速SOOrev.mirT1)中培养。经常用手摇晃烧杯， 以减少菌丝在烧杯壁上的生长。并于接种后逐日显微观察培养液中生成物的形态，第6天时检测生物量累积，孢子浓度和MS浓度。在每次实验中，从每个烧杯中取2次样，每种培养液设置3个烧杯重复。所有的实验至少重复2次。所述培养液成分包括(1)基础盐(g· Γ1) =KH2PO4,1. 5、MgSO4 · 7Η20，0. 5、 CaCl2 · 2Η20，0· 01 ； (2)微量元素(μ g · Γ1) =H3BO3, 30, MnSO4 · 4H20，40、CuSO4 · 5H20，80g ； ZnSO4 · 7H20，400、FeCl3 · 6H20，500 ； (3)复合维生素 B ( μ g · Γ1)硫胺，30、核黄素，15、吡哆胺，2、右旋泛酸钙，10; (4)氮源(g.L-1)大豆粉，15、玉米粉，15; (5)碳源(g · L-1)葡萄糖，25 ； (6)吐温-80 (ν/ν) :0%,0. 1%、0. 2%、0. 4%、0. 6%、0. 8%、1. 0%或 1. 2%。培养液的最终pH调至6. 8。在试验中保持基础盐、微量元素、复合维生素B、碳源固定，检测加入不同种类氮源和不同浓度吐温80组合后所得的结果。检测累积的生物量时，从培养烧杯中取ImL培养液，真空过滤到预称重的滤纸上。 滤纸于室温下真空干燥至稳定重量。根据滤纸前后重量的变化计算累积的生物量。检测微
5菌核浓度时，首先将培养液稀释到适宜MS计数为度，然后取100 μ L培养液于玻璃载玻片上，盖上盖玻片。显微计数玻片上所有的MS。只有直径超过50 μ m，独立的聚集菌丝体才计为MS。在培养液稀释和取样时，持续摇晃以确保均勻。检测孢子浓度时，首先将培养液稀释到适宜孢子计数为度。然后取100 μ L培养液于血球计数板上，盖上盖玻片。五点取样计算孢子数。1.4菌核的干燥球孢白僵菌培养8d后，向培养液中加入硅藻土(DE)，使浓度达到5gDE/100mL培养液。用循环水真空泵(SHZ-III，上海亚荣生化仪器厂)将MS-DE混合物抽滤到预称重的 Whatman No. M号滤纸上。将MS-DE混合物从滤纸上分离下来，用冷冻干燥机(LGJ-10D，北京四环仪器厂科学仪器有限公司)真空干燥至含水量<5%时，用封口机(上海鼎利轻工机械制造有限公司)包装于铝箔袋中，并于4°C贮存。2.氮源对球孢白僵菌微菌核、芽孢和生物量的影响最初的发酵实验表明(表1)，在固定基础盐，复合维生素B，微量元素，碳源和 0.4%的吐温80不变时，接入球孢白僵菌孢子悬浮液培养5d后，以大豆粉和玉米粉作为氮源的培养液，能观察到边缘光滑，发育良好的菌核，且两者间数量存在显著性差异(P < 0. 05)。表1氮源对球孢白僵菌生物量、芽孢和微菌核产量的影响
权利要求
1.一种虫生真菌菌核的培养方法，其特征是包括以下步骤1) 一级平板培养；幻孢子悬浮液的制备；；3)液体培养菌核；4)菌核的干燥。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征是所述虫生真菌为球孢白僵菌。
3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征是所述步骤1)的一级平板培养是真菌菌株在PDA培养基上培养待其产生孢子，将产生孢子的切成琼脂块，于甘油中超低温保存备用。
4.根据权利要求1-3之一所述的培养方法，其特征是所述步骤幻的孢子悬浮液的制备是将冷冻贮藏的琼脂块接种到PDA平板上，在室温下培养2 3周，加入含有0. 的聚乙二醇油酸基化合物的无菌水，无菌操作打散混勻、稀释，制成孢子悬浮液备用。
5.根据权利要求1-4之一所述的培养方法，其特征是所述步骤幻的液体培养菌核是将步骤幻制备的孢子悬浮液接入培养液中，放置于恒温摇床中培养，培养条件为温度 22-28 0C，摇速 280-300rpm，优选培养温度 25 °C，摇速 300rpm。
6.根据权利要求1-5之一所述的培养方法，其特征是所述步骤；3)液体培养菌核时所用的培养液组成包括基础盐(g·!^1)，微量元素(μ g·!/1)，复合维生素B (μ g ·Ι^)，氮源 (g-L—1)，碳源(g·!/1)和吐温-80(v/v)；其中，所述的基础盐(g.L—1)选自=KH2PO4O. 5-2. 0、 MgSO4 · 7H20 0. 5-2. 5 或 CaCl2 · 2H20 0. 01-0. 05 ；所述的微量元素(μ g · L—1)选自=H3BO3 5-30、MnSO4· 4H20 10-50、CuSO4· 5H20 50-80、ZnSO4· 7H20 50-400 或 FeCl3· 6H20 20-500 ； 所述的复合维生素Β(μ g · Γ1)选自硫胺5-30、核黄素2-15、吡哆胺0. 5-2或右旋泛酸钙 2-10 ；所述氮源(g 选自大豆粉5-15或玉米粉，5-15 ；所述的碳源(g · L—1)是葡萄糖 5-25 ；所述的吐温-80 (ν/ν)为0. 2-0. 8% ；培养液的最终ρΗ调至5. 5-7. 1。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征是所述步骤幻液体培养菌核时所用的培养液组成包括基础盐(g · L-1)，微量元素(μ g · L-1)，复合维生素B ( μ g · L-1)，氮源 (g.L—1)，碳源(g.L-1)和吐温-80(v/v)；其中所述的基础盐(g.L-1)选自=KH2PO4 1.5、 MgSO4 ·7Η200· 5 或CaCl2 ·2Η20 0. 01 ；所述的微量元素(μ g .Γ1)选自=H3BO3 30,MnSO4 ·4Η20 40、CuSO4 · 5Η20 80、ZnSO4 · 7Η20 400 或 FeCl3 · 6Η20 500 ；所述的复合维生素 B (μ g · Γ1) 选自硫胺30、核黄素15、吡哆胺2或右旋泛酸钙10;所述的氮源(g·!/1)选自大豆粉15 或玉米粉15 ；所述的碳源(g · Γ1)为葡萄糖25 ；所述的吐温-80 (ν/ν)为0. 4-0. 8% ；培养液的最终PH调至6. 8。
8.用上述权利要求1-7之一所述培养方法获得的虫生真菌菌核在制备防治害虫的生防制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征是所述虫生真菌为球孢白僵菌。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征是所述害虫为西花蓟马。
11.一种防治害虫的生防制剂，其特征是，包括通过上述权利要求1-7之一所述培养方法获得的虫生真菌菌核和辅料。
12.根据权利要求11所述的生防制剂，其特征是，所述虫生真菌菌核为球孢白僵菌。
13.根据权利要求11或12所述的生防制剂，其特征是，所述害虫为西花蓟马。
全文摘要
针对分生孢子作为昆虫病原真菌杀虫剂的繁殖体存在的缺陷，本发明提供了一种液体培养虫生真菌菌核的技术，所述虫生真菌可以是球孢白僵菌。本发明所提供的虫生真菌菌核的液体培养方法，需要将液体培养成分和培养条件控制在一定的范围内。培养出的菌核经过真空干燥后，可以长期贮藏，在适宜的条件下仍然能萌发出菌丝和有致病力的分生孢子。干燥制备的微菌核能够保持活力，复水后能够萌发出菌丝和孢子，增加了白僵菌作为西花蓟马土栖阶段生防因子的潜力。该技术成本低，菌核贮藏期长，非常适合推广普及。
文档编号C12N1/14GK102206587SQ20111010166
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者王海鸿, 问锦曾, 雷仲仁 申请人:中国农业科学院植物保护研究所