专利名称：检测烟草的烟气对肺的损伤的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测烟草的烟气对肺的损伤的方法及其应用。
背景技术：
国际上对烟草制品及烟用添加剂的安全性评价开展了大量研究工作。自20世纪90年代起，雷诺士(RJR)公司就以“Eclipse”卷烟为评价载体，一直进行烟草制品的安全性评价研究。其评估主要分为4个方面①有害烟气成分分析，包括焦油、烟碱、粒相物和气相物分析；②毒理学试验，包括遗传和细胞的体外毒理试验、啮齿动物呼吸系统(鼻、喉、肺)病理解剖、小鼠皮肤涂布致瘤试验以及DNA加合物分析；③吸烟试验，测定受试者的呼吸曲线、血清中的烟碱和羟基血色素、尿液变化，观察肺部炎症；④独立科学评价，由专家组对所掌握的全部的有关“Eclipse”的数据进行评价。英美烟草(BAT)公司的评价方法为卷烟烟气中“霍夫曼分析物”分析、烟气的体外短期毒性试验细菌基因突变——Ames测试、染色体畸形、微核测试和中性红细胞毒性测试ο菲利普·莫里斯(PM)公司的评价方法为烟气有害成分分析、体外细胞毒性及基因毒性试验、90d亚慢性毒性试验、临床试验和环境烟草烟气释放量分析等。1999年FDA (美国食品药品管理局)要求IOM(美国科学院医学研究所)制定一套科学的方法，用于评估长期使用药物产品或者烟草替代产品(用于降低而不是消除烟草危害)的安全性和效果。国际烟草科学研究合作中心(C0RESTA)也成立了相关的工作组(烟草烟气体外毒性测试工作组)，其主要任务是根据国际认可的体外毒性测试准则并加以修改，以适应烟草烟气的性质和独特特性，确定主要的方法。2002年，经过大量的文献调研和近三年的协作实验，工作组确定了三项实验评价卷烟产品的相对毒性——细菌诱变实验(推荐鼠伤寒沙门氏菌突变实验即Ames实验)、细胞遗传学/突变的哺乳动物细胞分析(工作组推荐微核分析或小鼠淋巴瘤L5178Y细胞分析或染色体畸变分析、用合适的哺乳动物细胞系进行的细胞毒性分析(工作组推荐中性红细胞毒性分析)。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测烟草的烟气对肺的损伤的方法及其应用。本发明提供的检测待测烟草的烟气对肺的损伤的方法，是通过检测待测烟草的烟气凝集物对离体的肺巨噬细胞的作用确定待测烟草的烟气对肺的损伤；所述作用体现为激活细胞的吞噬功能或抑制细胞生长。当烟气中有害物质的含量较低时，会激活所述细胞的吞噬功能。当烟气中有害物质的含量较高时，会抑制所述细胞生长。所述作用体现为激活细胞的吞噬功能时，所述检测待测烟草的烟气凝集物对离体的肺巨噬细胞的作用包括如下步骤比较所述烟气凝集物处理前后的所述离体的肺巨噬细胞对细菌的吞噬能力，确定所述烟气凝集物是否激活所述离体的肺巨噬细胞的吞噬功能。
所述细菌上可具有荧光素标记。所述荧光素优选为异硫氰酸荧光素(FITC)。所述方法中可采用流式细胞仪检测所述离体的肺巨噬细胞对所述细菌的吞噬能力。所述吞噬能力优选通过细胞内的平均荧光强度和/或异硫氰酸荧光素阳性细胞所占的比例体现。当烟气中有害物质的含量较低时，会激活所述细胞的吞噬功能，细胞内的平均荧光强度增强。当烟气中有害物质的含量较高时，会抑制所述细胞生长，细胞内的平均荧光强度反而降低。所述细菌可为大肠杆菌，如购自美国invitrogen公司，产品目录号为E-2861德 FITC标记的大肠杆菌。所述离体的肺巨噬细胞可为大鼠肺泡巨噬细胞株，优选为NR8383细胞。离体的肺巨噬细胞在制备检测待测烟草的烟气对肺的损伤的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。所述离体的肺巨噬细胞可为大鼠肺泡巨噬细胞株，优选为NR8383细胞。所述烟气凝集物具体可通过如下方法制备将卷烟、装有乙酸乙酯的气体采样管 (大包氏管)、装有F12K培养基的气体采样管(大包氏管)和吸烟机依次串联后用所述吸烟机进行抽吸，然后将所述乙酸乙酯和所述F12K培养基混合，最后挥发所述乙酸乙酯，得到烟气凝集物。本发明还保护一种检测待测烟草的烟气对肺的损伤的试剂盒，包括离体的肺巨噬细胞和能被所述离体的肺巨噬细胞吞噬的细菌。所述细菌可为大肠杆菌，如购自美国invitrogen公司，产品目录号为E-2861德 FITC标记的大肠杆菌。所述离体的肺巨噬细胞可为大鼠肺泡巨噬细胞株，优选为NR8383细胞。以上任一所述的方法，或任一所述的试剂盒可用于评价烟草的安全性。人吸烟后，卷烟烟气最直接的作用部位是肺，尤其肺的固有(天然)免疫系统首当其冲。肺巨噬细胞是肺部免疫系统的重要细胞成分，在非特异性免疫防御及特异性免疫应答中均起十分关键的作用。肺巨噬细胞也是沉积于肺中的烟气积聚物的主要清除细胞，显微镜下观察呼吸性细支气管腔内聚集了大量吞噬了烟尘颗粒的肺泡巨噬细胞。因而评价卷烟烟气影响肺巨噬细胞吞噬功能，对全面评价卷烟烟气的安全性及烟草生产的减害研究具有重要意义。
图1为未经CSC处理的NR8383细胞的流式细胞仪检测结果。图2为CSC处理后的NR8383细胞的流式细胞仪检测结果。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞(NR8383细胞)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，产品目录号为GNR9。FITC标记的大肠杆菌(E.coli)购自美国 invitrogen公司，产品目录号为E-2861。磷酸盐缓冲液(PBS,ρΗ7· 4)称取 63. 03g Na2HPO4 · 12Η20，3· 74g NaH2PO4 · 2H20， 溶于1000ml去离子水，调pH至7. 4，高压灭菌或过滤除菌。LB培养基称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g及NaC15g，溶于800ml去离子水中， 调节PH为7. 4，定容至1000ml，高压灭菌。LB琼脂平板量取未灭菌的LB培养基100ml，加入1. 5g琼脂，高压灭菌，待温度降低至80°C左右，无菌条件下倒入消毒的90mm玻璃皿中，每皿约25ml，待凝固后37°C过夜，以除去水分及检查有无污染。0. 2mol/L Na2CO3 溶液称取 21. 198g Na2CO3,溶于 IOOOml 去离子水中。0. 2mol/L NaHCO3 溶液称取 16. 80g NaHCO3，溶于 IOOOml 去离子水中。0. 2mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9. 5)量取 13. Oml 的 0. 2mol/L Na2CO3 溶液与 37. Oml 的0. 2mol/L NaHCO3溶液，混勻后过滤除菌。台盼蓝溶液4g台朌蓝加双蒸水100ml，研磨溶解，离心后取上清；将上清与 1. 8g/100mL氯化钠水溶液等体积混合，得到2%台朌蓝溶液，使用前稀释10倍。灭活胎牛血清将胎牛血清化冻后置于56°C灭活30min，中间每隔5min震荡1次， 冷却后4°C保存。F12K培养基购于北京迈晨科技公司，产品目录号为CM10025。实施例1、一、细胞培养采用含有15% (体积百分含量)灭活胎牛血清的F12K培养基，在37°C、5%C(V_ 温细胞培养箱中培养NR8383细胞，得到NR8383细胞的细胞液。二、评价烟草的安全性1、制备烟气凝集物(CSC)采用10支2R4F参比卷烟(美国肯塔基大学)作为实验烟，抽吸前置于温度 (22士 1)°C和湿度(60士2)%的恒温恒湿箱中平衡72h小时。采用气体采样管(大包氏管) 采集烟气，2个串联的气体采样管分别装有5ml乙酸乙酯和5mlF12K培养基，乙酸乙酯端连接卷烟，F12K培养基端连接郑州烟草研究院研制JJ-100型单通道吸烟机抽吸，提取条件为 lpuff/min(25mL/puff)。10支卷烟抽吸完成后将5ml乙酸乙酯和5mlF12K培养基混合，将乙酸乙酯挥发，剩余液体用F12K培养基定容至10ml，即为烟气凝集物(1支烟/ml)。-80°C 保存。2、细胞染毒(用CSC处理NR8383细胞)取NR8383细胞的细胞液(含IO5细胞)，加入Iml烟气凝集物，在37°C、5% CO2恒温细胞培养箱中培养24h。3、吞噬功能检测收集NR8383细胞(CSC处理后的NR8383细胞或未经CSC处理的NR8383细胞)，室温离心(2500rpm,5mins)取沉淀，磷酸盐缓冲液(PBS, ρΗ7· 4)洗三次，加入0. 5mL含15% (体积百分含量)灭活胎牛血清的F12k培养基重悬细胞，转入24孔板中；然后加0. 5mLFITC标记的大肠杆菌菌液，于在37°C、5% CO2恒温细胞培养箱中孵育2h ；收集24孔板的混悬液，室温离心(2500rpm，5minS)取沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7. 4)洗两次；采用流式细胞仪检测(检测前Imin加入台盼蓝溶液)，采集FITC荧光，计算FITC阳性细胞所占比例及细胞内平均荧光强度，分析细胞的吞噬功能。 未经CSC处理的NR8383细胞的流式细胞仪检测结果见图1。CSC处理后的NR8383 细胞的流式细胞仪检测结果见图2。CSC处理后的NR8383细胞和未经CSC处理的NR8383 细胞FITC阳性细胞所占比例均为100%。CSC处理后的NR8383细胞内平均荧光强度为 16. 36 士 2. 06，未经CSC处理的NR8383细胞内平均荧光强度为10. 02 士 0. 89。CSC处理后的 NR8383细胞与未经CSC处理的NR8383细胞相比，荧光强度增加了 50%以上。结果表明CSC 异常激活NR8383细胞的吞噬功能，对肺脏免疫系统产生损伤。
权利要求
1.一种检测待测烟草的烟气对肺的损伤的方法，是通过检测待测烟草的烟气凝集物对离体的肺巨噬细胞的作用确定待测烟草的烟气对肺的损伤；所述作用体现为激活细胞的吞噬功能或抑制细胞生长。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测待测烟草的烟气凝集物对离体的肺巨噬细胞的作用包括如下步骤比较所述烟气凝集物处理前后的所述离体的肺巨噬细胞对细菌的吞噬能力，确定所述烟气凝集物是否激活所述离体的肺巨噬细胞的吞噬功能。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述细菌上具有荧光素标记；所述方法中， 采用流式细胞仪检测所述离体的肺巨噬细胞对所述细菌的吞噬能力；所述荧光素优选为异硫氰酸荧光素；所述吞噬能力优选通过细胞内的平均荧光强度和/或异硫氰酸荧光素阳性细胞所占的比例体现。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述细菌为大肠杆菌。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述离体的肺巨噬细胞为大鼠肺泡巨噬细胞株，优选为NR8383细胞。
6.离体的肺巨噬细胞在制备检测待测烟草的烟气对肺的损伤的试剂盒中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述离体的肺巨噬细胞为大鼠肺泡巨噬细胞株，优选为NR8383细胞。
8.检测待测烟草的烟气对肺的损伤的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括离体的肺巨噬细胞和能被所述离体的肺巨噬细胞吞噬的细菌。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述细菌为大肠杆菌，优选为FITC标记的大肠杆菌；所述离体的肺巨噬细胞为大鼠肺泡巨噬细胞株，优选为NR8383细胞。
10.权利要求1至5中任一所述的方法，或权利要求8至9中任一所述的试剂盒在评价烟草的安全性中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测烟草的烟气对肺的损伤的方法及其应用。本发明提供的方法，是通过检测待测烟草的烟气凝集物对离体的肺巨噬细胞吞噬功能的损伤得到待测烟草的烟气对肺的损伤。人吸烟后，卷烟烟气最直接的作用部位是肺，尤其肺的固有(天然)免疫系统首当其冲。肺巨噬细胞是肺部免疫系统的重要细胞成分，在非特异性免疫防御及特异性免疫应答中均起十分关键的作用。肺巨噬细胞也是沉积于肺中的烟气积聚物的主要清除细胞，显微镜下观察呼吸性细支气管腔内聚集了大量吞噬了烟尘颗粒的肺泡巨噬细胞。因而评价卷烟烟气影响肺巨噬细胞吞噬功能，对全面评价卷烟烟气的安全性及烟草生产的减害研究具有重要意义。
文档编号C12Q1/02GK102220405SQ20111010167
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月22日 优先权日2011年4月22日
发明者刘姜瑾, 朱茂祥, 杨陟华, 潘秀颉, 胡旺顺, 钟科军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 湖南中烟工业有限责任公司