专利名称：利用花生壳粉固态发酵制备饲用β-葡聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵，特别是一种利用花生壳粉固态发酵制备饲用β-葡聚糖酶的方法。
背景技术：
葡聚糖属一种非淀粉多糖，是由β_1，3葡萄糖苷键与β _1，4糖苷键连接而成的多糖，存在于大麦、燕麦、小麦等的糊粉层和胚乳植物细胞壁中，在水溶液中具有较高粘性。 单胃动物由于自身不具备合成β -葡聚糖酶的微生物及分解葡聚糖的酶系，使食糜在肠道中具有较高的粘度，而阻止蛋白质和脂肪营养的吸收，表现出较强的抗营养作用，降低饲料的转化率，抑制畜禽生长，最终导致动物产出成本的增加。饲用葡聚糖酶应用于饲料工业中降解饲料中抗营养因子葡聚糖，使其失去亲水性和粘性、改变单胃动物肠道内容物的粘度及消化酶的活性，提高饲料利用率、畜禽的生长性能及整齐度。产生β-葡聚糖酶的主要以下途径在植物萌芽早期过程中产生，大麦等谷类种子发芽过程中产生葡聚糖酶催化水解胚乳细胞壁中的葡聚糖，解除其对胚乳中其它营养物质的抗性作用，可以降低浸提物的粘度，其催化时表现出对底物的糖苷键极强的专一性。另一途径主要来源为微生物发酵产生葡聚糖酶，有关产葡聚糖酶的微生物来源主要有细菌、真菌和瘤胃微生物。目前国内外主要利用微生物法生产葡聚糖酶。利用细菌如枯草芽孢杆菌生产葡聚糖酶一般采用液态发酵工艺；利用曲霉菌发酵生产葡聚糖酶通常采用固态发酵工艺，也有的采用液态发酵工艺。饲用葡聚糖酶的生产一般采用固态发酵工艺，微生物在产生葡聚糖酶的同时，还产生蛋白酶等其它酶类，其它的酶蛋白有助于提高和保护葡聚糖酶的酶活性。饲料用酶制剂的生产，国外企业多采用单菌种纯种液态发酵工艺生产出单项酶制剂，此法投入大，酶成本高，由于我国饲料工业产品附加值低，不适合我国饲料养殖业现状。因此，难以有效推广应用，满足不了养殖业对饲料生产上的需要，其创新势在必行。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用花生壳粉固态发酵制备饲用β-葡聚糖酶的方法，可有效解决饲用β-葡聚糖酶的制备，以满足养殖业对饲料生产的需要。制备方法包括菌种制备、饲用β -葡聚糖酶的生产、检测复合等工艺步骤。与现有技术相比，本发明针对我国饲料养殖业现状，可应用在饲料工业。本发明是由以下步骤实现Α.菌种制备，方法是1.菌种活化，采用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，将黑曲霉菌株接入试管内马铃薯葡萄糖(PDA)培养基的斜面上，28-30°C培养至出现黑色菌落，然后再从培养斜面上挑取黑色孢子转接入另一试管培养基斜面上，出现黑色菌落后重复以上操作，连续转接三次，成为活性菌种，即菌种活化；2. 一级种子培殖，方法是，首先配制一级种子用培养基，将麸皮IOOgdK IOOml混配成培养基，装入培养皿中，每500ml的容积内装入培养基30g，进行高压灭菌，在0. IMpa 灭菌30min，灭菌后冷却至35°C待用；然后，将步骤1得到的活化菌株接种于已灭菌冷却后的培养基中，接种量为每500ml的容积内接入培养基重量的0. 2-0. 6%，于培养 65-72h,得到一级种子，一级种子镜检孢子数为不低于90亿个/g ；3. 二级种子培殖，方法是，将每IOOOml的容积内装入与一级种子培养基相同的二级种子培养基50g，将一级种子按培养基重量的0. 3% -0. 5%的比例接入培养基中，于
培养65-7池，得二级种子，二级种子镜检孢子数为不低于60亿个/g，得扩殖的二级种子，备用；B.制备培养基饲用β-葡聚糖酶，方法是1.制备发酵培养基花生壳粉15g、麸皮70g、豆粕粉10g、大麦粉5g、(NH4) 2S042g, MgSO4 · 7H20 0. 5g、K2HPO4Ig, NaNO3Ig^jC 100ml，其中，豆粕粉、大麦粉用部分水润湿 2_4h， (NH4)2SO4, MgSO4 · 7H20、K2HP04g、NaNO3首先溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生壳粉、麸皮及已润湿的豆粕粉、大麦粉中，混合均勻后装入灭菌锅中，灭菌1. 得灭菌后的固体发
酵培养基，备用；2.冷却接种，将灭菌后的固体发酵培养基冷却至35°C后，接入步骤A中扩殖的二级种子，接种比例为固体发酵培养基重量的0. 3-0. 5%，入发酵床培养；3.发酵培养，将接种后的培养基置于发酵床，在室温30°C，湿度90%，培养基料温度不超过37°C，发酵37h ；发酵物为淡黄色或浅褐色，有发酵物的天然风味；4.烘干，在温度35-50°C下烘干，粉碎过0. 42mm孔径筛，分装即可。本发明具有以下优点1.发酵培养基原料主要为普通农副产物花生壳粉、麸皮等价格低廉、简单易得；2.培养方便，生长速度快，发酵周期大大缩短，只有37h;3.能产生饲用β-葡聚糖酶制剂；4.饲用β-葡聚糖酶酶活力高，耐热性好，应用效果好，经济社会效益显著；5.采用我国农业部许可微生物菌株黑曲霉菌进行发酵，安全性高，不产生有害物质，是绿色饲用添加剂。
四
图1为本发明的工艺流程图。
五具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式
作详细说明。由附图给出，本发明在具体实施中是由以下步骤实现的Α.菌种制备1.菌种活化，所采用的发酵菌株为黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，将保藏的黑曲霉菌株接入试管内马铃薯葡萄糖(PDA)培养基的斜面上，^rc培养至出现黑色菌落，然后从试管斜面上挑取黑色孢子转接入另一试管内马铃薯葡萄糖(PDA)培养基的斜面上，出现黑色菌落后再接入第三试管内马铃薯葡萄糖(PDA)培养基的斜面上，连续转接三次，成为活性菌种；
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2. 一级种子培殖，首先制备一级种子用培养基，该培养基由麸皮IOOgdK IOOml混勻制成，将一级种子用培养基装入500ml三角瓶中，每个500ml三角瓶接入一级种子培养基30g，在0. IMpa下灭菌30min，灭菌后冷却至35°C待用；将活性菌种接种于已灭菌冷却后的一级种子培养基中，每个500ml的三角瓶内接入一级种子培养基重量的0. 4%的种子，于 ^TC培养68h，得到一级种子，一级种子镜检孢子数不低于90亿个/g ；3. 二级种子培殖，将与一级种子的培养基相同的二级种子培养基装入IOOOml的三角瓶中，每个IOOOml的三角瓶装入二级种子的培养基50g，一级种子按0. 4%的比例接入二级种子用培养基中，在^TC培养68h，得到二级种子，二级种子镜检孢子数不低于60亿个 /g;B.饲用β -葡聚糖酶的制备1.首先制备固体发酵培养基，该培养基是由花生壳粉15g、麸皮70g、豆粕粉10g、 大麦粉 5g、(NH4)2S042g、MgSO4 ·7Η20 0. 5g、K2HP04lg、NaN03lg、7jC 100ml 制成，其中，豆粕粉、 大麦粉用部分水润湿3h，无机盐(NH4) 2S04、MgSO4 · 7H20、K2HPO4g, NaNO3溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生壳粉、麸皮及已润湿的豆粕粉、大麦粉中，混合均勻后装入灭菌锅中，常压灭菌1. ，成固体发酵培养基，备用；2.冷却接种，将灭菌后的固体发酵培养基冷却至35°C，接入二级种子，接种比例为0.4%，置入发酵床培养；3.发酵床培养，室温30°C，湿度90%，培养基料温度36°C，发酵37h，成淡黄色或浅褐色的发酵物；4.发酵物处理，首先在48°C下烘干，再粉碎，过0. 42mm孔径筛，经检测合格后为成品，分装。本发明方法简单，易于生产，费用低，生产周期短，应用效果好，是绿色的饲用添加剂，并经试验取得了满意的效果，有关试验资料如下1. β -葡聚糖酶耐受饲料加工的能力饲料加工包括颗粒料加工、粉料加工。表1高温对加酶饲料酶活力的影响
权利要求
1.一种利用花生壳粉固态发酵制备饲用葡聚糖酶的方法，其特征在于由以下步骤实现Α.菌种制备，方法是(1)菌种活化，采用黑曲霉菌株，将黑曲霉菌株接入试管内马铃薯葡萄糖培养基的斜面上，28-30°C培养至出现黑色菌落，然后再从培养斜面上挑取黑色孢子转接入另一试管培养基斜面上，出现黑色菌落后重复以上操作，连续转接三次，成为活性菌种，即菌种活化；(2)一级种子培殖，方法是，首先配制一级种子用培养基，将麸皮IOOgdK 100 ml混配成培养基，装入培养皿中，每500 ml的容积内装入培养基30 g，进行高压灭菌，在0. IMpa 灭菌30min，灭菌后冷却至35°C待用；然后，将步骤1得到的活化菌株接种于已灭菌冷却后的培养基中，接种量为每500 ml的容积内接入培养基重量的0. 2-0. 6%，于培养 65-7池，得到一级种子，一级种子镜检孢子数为不低于90亿个/g ；(3)二级种子培殖，方法是，将每1000 ml的容积内装入与一级种子培养基相同的二级种子培养基50 g，将一级种子按培养基重量的0. 3%-0. 5%的比例接入培养基中，于培养65-7池，得二级种子，二级种子镜检孢子数为不低于60亿个/g，得扩殖的二级种子，备用；B.制备培养基饲用葡聚糖酶，方法是(1)制备发酵培养基花生壳粉15g、麸皮70g、豆粕粉10 g、大麦粉5g、(NH4)2 SO4 2 g、 MgSO4'7H20 0. 5g,K2HPO4 1 g,NaNO3 lg、水100ml，其中，豆粕粉、大麦粉用部分水润湿2_4h， (NH4) 2 S04、MgS04*7H20、K2HP04 g,NaNO3首先溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生壳粉、麸皮及已润湿的豆粕粉、大麦粉中，混合均勻后装入灭菌锅中，灭菌1. 得灭菌后的固体发酵培养基，备用；(2)冷却接种，将灭菌后的固体发酵培养基冷却至35°C后，接入步骤A中扩殖的二级种子，接种比例为固体发酵培养基重量的0. 3-0. 5%，入发酵床培养；(3)发酵培养，将接种后的培养基置于发酵床，在室温30°C，湿度90%，培养基料温度不超过37°C，发酵37h ；发酵物为淡黄色或浅褐色，有发酵物的天然风味；(4)烘干，在温度35-50°C下烘干，粉碎过0.42mm孔径筛，分装即可。
2.利用花生壳粉固态发酵制备饲用葡聚糖酶的方法，其特征在于，由所述的以下步骤实现Α.菌种制备(1)菌种活化，所采用的发酵菌株为黑曲霉菌株，将保藏的黑曲霉菌株接入试管内马铃薯葡萄糖培养基的斜面上，^rc培养至出现黑色菌落，然后从试管斜面上挑取黑色孢子转接入另一试管内马铃薯葡萄糖培养基的斜面上，出现黑色菌落后再接入第三试管内马铃薯葡萄糖培养基的斜面上，连续转接三次，成为活性菌种；(2)一级种子培殖，首先制备一级种子用培养基，该培养基由麸皮100g、水IOOml混勻制成，将一级种子用培养基装入500ml三角瓶中，每个500ml三角瓶接入一级种子培养基 30g，在0. IMpa下灭菌30min，灭菌后冷却至35°C待用；将活性菌种接种于已灭菌冷却后的一级种子培养基中，每个500ml的三角瓶内接入一级种子培养基重量的0. 4%的种子，于培养68h，得到一级种子，一级种子镜检孢子数不低于90亿个/g ；(3)二级种子培殖，将与一级种子的培养基相同的二级种子培养基装入IOOOml的三角瓶中，每个IOOOml的三角瓶装入二级种子的培养基50g，一级种子按0. 4%的比例接入二级种子用培养基中，在^TC培养68h，得到二级种子，二级种子镜检孢子数不低于60亿个/g ；B.饲用β -葡聚糖酶的制备(1)首先制备固体发酵培养基，该培养基是由花生壳粉15g、麸皮70g、豆粕粉10 g、大麦粉 5g、(NH4) 2 SO4 2 g, MgSO4·7Η20 0. 5g、K2HPO4 1 g、NaNO3 lg、水 100ml 制成，其中，豆粕粉、大麦粉用部分水润湿池，无机盐(NH4) 2 SO4, MgSO4-7H20, K2HPO4 g、NaNO3溶解于部分水中，然后撒入拌勻的花生壳粉、麸皮及已润湿的豆粕粉、大麦粉中，混合均勻后装入灭菌锅中，常压灭菌1. ，成固体发酵培养基，备用；(2)冷却接种，将灭菌后的固体发酵培养基冷却至35°C，接入二级种子，接种比例为 0.4%，置入发酵床培养；(3)发酵床培养，室温30°C，湿度90%，培养基料温度36°C，发酵37h，成淡黄色或浅褐色的发酵物；(4)发酵物处理，首先在48°C下烘干，再粉碎，过0. 42mm孔径筛，经检测合格后为成品， 分装。
全文摘要
本发明涉及利用花生壳粉固态发酵制备饲用β-葡聚糖酶的方法，可有效解决饲用β-葡聚糖酶的制备，以满足养殖业对饲料生产的需要，其制备方法是A.菌种制备，方法是先菌种活化，再进行一级种子培殖、二级种子培殖；B.制备培养基饲用β-葡聚糖酶，方法是先制备发酵培养基，然后冷却接种，接入步骤A中扩殖的二级种子，入发酵床培养，发酵，发酵物为淡黄色或浅褐色，有发酵物的天然风味，再烘干，粉碎，分装即可。本发明发酵培养基原料主要为普通农副产物花生壳粉、麸皮等；培养方便，生长速度快，发酵周期大大缩短，只有37h；能产生饲用β-葡聚糖酶制剂；饲用β-葡聚糖酶酶活力高，耐热性好，应用效果好；采用微生物菌株黑曲霉菌进行发酵，安全性高，不产生有害物质。
文档编号C12R1/685GK102242091SQ20111010104
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者刘德海, 庞向宇, 王红云, 胡宜亮, 陈国参 申请人:河南省科学院生物研究所有限责任公司