0 :重组表达菌株。
[0034] 图 10 显示了破菌后的 HPV58L1 上清液 Western-blot 鉴定。1 :PageRuler Prestained Protein Ladder ;2_5 :重组表达菌株。
[0035] 图11显示了 HPV6L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-9 :重组纯化蛋白样品；10 : PageRuler Prestained Protein Ladder。
[0036] 图12显示了 HPV11L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-4 :重组纯化蛋白样品；5 : PageRuler Prestained Protein Ladder ;6_8 :重组纯化蛋白样品。
[0037] 图13显示了 HPV16L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-7 :重组纯化蛋白样品；8 : PageRuler Prestained Protein Ladder。
[0038] 图14显示了 HPV18L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-4 :重组纯化蛋白样品；5 : PageRuler Prestained Protein Ladder ;6_7 :重组纯化蛋白样品。
[0039] 图15显示了 HPV58L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1-5 :重组纯化蛋白样品；6 : PageRuler Prestained Protein Ladder ;7_8 :重组纯化蛋白样品。
[0040] 图16显示了 HPV6L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
[0041] 图17显示了 HPV11L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
[0042] 图18显示了 HPV16L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
[0043] 图19显示了 HPV18L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
[0044] 图20显示了 HPV58L1纯化后病毒样颗粒透射电镜照片。
[0045] 序列说明
[0046] SEQ ID N0 :1为野生型HPV6L1氨基酸序列。
[0047] SEQ ID N0 :2为野生型HPV11L1氨基酸序列。
[0048] SEQ ID N0 :3为野生型HPV16L1氨基酸序列。
[0049] SEQ ID N0 :4为野生型HPV18L1氨基酸序列。
[0050] SEQ ID N0 :5为野生型HPV58L1氨基酸序列。
[0051] SEQ ID N0 :6为本发明的HPV6L1基因的核苷酸序列。
[0052] SEQ ID N0 :7为本发明的HPV11L1基因的核苷酸序列。
[0053] SEQ ID N0 :8为本发明的HPV16L1基因的核苷酸序列。
[0054] SEQ ID N0 :9为本发明的HPV18L1基因的核苷酸序列。
[0055] SEQ ID N0 :10为本发明的HPV58L1基因的核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0056] 通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发 明。下述实施例仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数 字（如数量、温度等）的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，温 度以°C为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。除非另有说明，在下述各实施例中 用到的限制性内切酶均购自New England Biolab公司。应当理解的是，除非另有说明，下 述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明，所使用的培养基 均为市售可得的常规培养基，本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见，在 本文中有可能使用各种通用的缩写，本领域技术人员完全能够理解其含义。
[0057] 实施例
[0058] 实施例1 :HPVL1密码子优化设计
[0059] 遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕 赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的，每个氨基酸 都由一个以上的密码子编码，同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同 的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平，本发明人根据 野生型的 HPV6L1 氛基酸序列（Genebank CBY85547. 1)，HPV11L1 氛基酸序列（Genebank CCE60515. 1)，HPV16L1 氨基酸序列（Genebank AAC09292. 1)，HPV18L1 氨基酸序列 (Genebank AAP20601. 1)和 HPV58L1 氛基酸序列（Genebank BAA31851. 1)进行基因序列改 造：对其所有的氨基酸基因全部采用使用频率最高和较高的密码子。Pichia酵母密码子使 用频率见表1(参见http: //WWW.kazusa.or.jp / codon / )。然后在此基础上，又为 了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶 切位点，本发明人对最高频率的密码子进行一定的修正，例如将一些天冬酰胺（Asn)最高 频率密码子AAC修正为AAT，赖氨酸（Lys)最高频率密码子AAG修正为AAA，天冬氨酸（Asp) 最高频率密码子GAT修正为GAC，苯丙氨酸（Phe)最高频率密码子TTT修正为TTC，酪氨 酸（Tyr)最高频率密码子TAC修正为TAT，甘氨酸（Gly)最高频率密码子GGT修正为GGA。 改造后的HPVL1基因序列不含有以下内含子识别序列及转录因子结合位点：ATGACTCAT和 TGACTA (转录因子GCN4结合位点）；ATATAA(GAL4的结合位点）；TATTTAA(TBP结合位点）； TTAGTAA 和 TTACTAA(YAP1 结合位点）；ATGACTAAT ;ACTAATTAGG。
[0060] 由此，本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的HPV L1基因的核苷酸序 列，按照所述的序列全合成了 HPV L1基因，将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中，通过同源 重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株；利用重组毕赤酵母进行发酵培养 和甲醇诱导胞内表达HPV L1蛋白。从中分别筛选出全新的HPV L1基因的核苷酸序列，可分 别在毕赤酵母中高表达HPV L1蛋白，并在胞内同时形成病毒样颗粒（VLPs)，破菌上清经过 层析方法纯化后，纯化的病毒样颗粒纯度大于90%，吸附铝佐剂后，具有极高的免疫原性， 可作为人用预防宫颈癌的疫苗。这些优化设计的HPV L1基因的核苷酸序列如SEQ ID N0: 6, SEQ ID NO :7, SEQID NO :8, SEQ ID NO :9 或 SEQID NO :10 所示。
[0061] 表lPichia酵母密码子表
[0062]
【主权项】
1. 一种分离的基因，其编码人乳头瘤主要衣壳蛋白L1，其特征在于，所述的基因具有 毕赤酵母偏爱的密码子。
2. 如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因具有SEQIDNO :6, SEQIDNO :7， SEQIDN0 :8, SEQIDN0 :9 或 SEQIDN0 :10 所示核苷酸序列。
3. -种表达载体，所述的表达载体中含有权利要求1-2中任一项所述的基因的序列。
4. 一种基因工程化的宿主细胞，所述的细胞含有权利要求3所述的表达载体，或其基 因组中整合有权利要求1-2中任一项所述的基因。
5. 如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞是毕赤酵母细胞。
6. 根据权利要求5所述的毕赤酵母菌株，其特征是，选自毕赤酵母X-33、GSl 15、KM71 和SMDl 168菌株。
7. -种具有免疫原性的大分子，该大分子的直径为50-80nm，主要由人乳头状瘤病毒 主要衣壳蛋白Ll自我装配而成，所述的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白Ll是毕赤酵母表达 的。
8. 如权利要求7所述的大分子，其特征在于，所述的具有免疫原性的大分子通过以下 方法制备获得： (1) 培养权利要求4所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒 主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子； (2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
9. 一种制备权利要求7所述的具有免疫原性的大分子的方法，其特征在于，所述方法 包括： (1) 培养权利要求4所述的宿主细胞，从而在宿主细胞内表达所述的人乳头状瘤病毒 主要衣壳蛋白L1，并组装形成具有免疫原性的大分子； (2) 分离所述的具有免疫原性的大分子。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤（2)中包括： (a) 破碎步骤（1)获得的宿主细胞，获得含有具有免疫原性的大分子的上清液；和 (b) 将步骤（a)获得的上清液依次采用离子交换柱层析和羟基磷灰石柱层析进行纯 化，从而获得所述的具有免疫原性的大分子。
11. 一种具有免疫原性的组合物，其特征在于，所述的组合物中含有： (i) 有效量的权利要求7所述的具有免疫原性的大分子；和 (ii) 药学上可接受的载体。
12. 权利要求7所述的具有免疫原性的大分子的用途，其特征在于，用于预防或治疗人 乳头状瘤病毒感染相关疾病。
13. -种在毕赤酵母中表达HPV6,11，16,18和58L1基因的方法，包括下述步骤： (1) 将经密码子优化的HPV6,11，16,18或58L1基因克隆入表达载体中； (2) 将步骤（1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中； (3) 使用抗生素对步骤（2)所得的转化菌株进行筛选，获得生长情况最好的一个或多 个菌株； (4) 通过测试HPV6,11，16,18或58L1基因的表达量对步骤（3)所得的菌株进行进一步 筛选，获得表达量最高的一个或多个菌株； (5)使用步骤（4)所得的菌株进行表达，获得HPV6,11，16,18或58L1蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一类密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因，所述基因在被转入酵母细胞后可高效地表达重组人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1。本发明还公开了一种具有免疫原性的大分子，其主要由所述经密码子优化的人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1编码基因在酵母细胞中表达产生。本发明还公开了所述具有免疫原性的大分子的应用和组合物。
【IPC分类】C07K14-025, A61K39-12, C12N1-19, C12N15-81, A61P31-20, C12N15-37
【公开号】CN104845985
【申请号】CN201410054725
【发明人】田平生, 仝鑫, 许丹, 丛薇, 刘瑞峰, 张梦华, 葛方昕, 魏健, 刘家骅, 邬丹丽, 曾宪放, 王子龙, 史力
【申请人】上海泽润生物科技有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2014年2月18日