一种增强d-苯基乳酸产量的d-ldh-fdh融合基因的构建与表达的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合 基因的构建与表达。
【背景技术】
[0002] 苯基乳酸（phenyllactic acid, PLA)，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种新型的生 物防腐剂，它具有抗革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌等功能。此外，苯基乳酸还是中药提取物 "丹参素"的类似物，具有一定的药用价值。因此苯基乳酸的开发和利用具有广泛的应用 前景。目前，苯乳酸主要由化学合成或微生物转化两种方式获得，化学合成法在不同程度 上存在污染环境、技术复杂、条件苛刻、副产物多等缺陷。因此，研宄人员将研宄方向转向 了生物合成法。近几年用于苯乳酸研宄的微生物主要有白地霉、丙酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌 等。2000年，LAVERMICOCCA P等首次报道从酸面团中分离到的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) 21B，苯乳酸产量达到56. 44mg/L。随后研宄相继获得多株产苯乳酸的乳酸菌，但 菌株间产量差异较大，且苯乳酸产量相对都较低。
[0003] 乳酸脱氢酶是自然界微生物细胞内转化苯丙酮酸生成苯基乳酸的关键酶，但由于 该酶催化过程中需要消耗体系中的还原型辅酶，还原型辅酶的额外添加使反应成本显著增 加。因此开发系统中还原型辅酶再生的方法亦是研宄的关键。近年来，甲酸脱氢酶在辅酶 再生中的应用已成为辅酶酶法再生研宄领域的热点之一，甲酸脱氢酶体系是最成功的再生 体系。因此，如果能在乳酸脱氢酶催化苯丙酮酸转化生成苯基乳酸的同时，结合甲酸脱氢酶 应用于辅酶NADH的酶耦联法再生系统，可能能够大幅度提高苯乳酸产量。流程示意如下：
【主权项】
1. 一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-抑H融合基因的cDNA序列，其特征在于：由 D-LDH基因、连接肤的DNA序列和抑H基因串联而成，其核巧酸序列如SEQIDNo. 1所示，编 码SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列，W及经过取代、缺失或者叠加一个或几个氨基酸衍生的 蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于；所述的核巧酸序列中1-996来自 D-LDH基因，序列99化P;997-10"bp为连接肤的DNA序列，共45bp;1042-2133bp来自抑H 基因，序列l〇92bp。
3. 根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于：所述的连接肤的DM序列如SEQID No. 3所示，编码的氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示，包括12个甘氨酸和3个丝氨酸。
4. 权利要求1所述的cDNA序列的构建方法，其特征在于：该方法包括W下步骤： (1) 设计PCR引物，使D-L畑的下游引物和抑H的上游引物具有一段重叠互补区域； (2) 分别通过PCR反应扩增两个基因； (3)利用overlap extension PCR技术，将两个基因片段拼接起来，同时在两个基因之 间添加柔性的连接肤序列。
5. 权利要求4所述的方法，其特征在于；所述的PCR引物序列如下： D-LDH引物； 上游引物；5'-CGCGGATCCG\ aT g\AAAATTATTGCATATGC-3'（SEQIDNo. 5); 下游引物；5'-GTCAAACTTAACTTGTGTG-3'（SEQIDNo. 6); 抑H引物； 上游引物；5'-CACACAAGTTAAGTTTGACGGCGGTGGCGGCAGCGGCGGAGGCGG AAGCGGAGGCGGAGGAAGCATGAAGATCGTTTTAGTC-3'（沈QIDNo. 7); 下游引物；5,-AACTGCAGTTATTTCTTATCGTGTTTACCG-3'（SEQIDNo. 8)。
6. -种载体，包含权利要求1所述的cDNA序列。
7. -种宿主细胞，含有权利要求6所述的载体。
8. -种权利要求1所述的cDNA序列的表达方法，包括用权利要求6所述的载体，转化 权利要求7所述的宿主细胞，诱导表达得融合蛋白。
【专利摘要】本发明涉及一种增强D-苯基乳酸产量的D-LDH-FDH融合基因的cDNA序列，由D-LDH基因、连接肽的DNA序列和FDH基因串联而成。本发明还提供了该融合基因的构建方法以及表达方法。本发明将乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶通过连接肽串联得到融合蛋白，该蛋白在大肠杆菌中表达后，保持了两种酶的活性，并且融合蛋白中的乳酸脱氢酶的酶活性较单独表达时高，较乳酸脱氢酶，甲酸脱氢酶在同一细胞内分开表达时高，催化苯丙酮酸转化成苯基乳酸时表现出更强的催化效果。
【IPC分类】C12N9-04, C12N15-53, C12N15-10
【公开号】CN104845988
【申请号】CN201510254279
【发明人】朱益波, 王立梅, 齐斌, 蒋卓越, 季伟
【申请人】常熟理工学院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月19日