一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法。
【背景技术】
[0002]转录激活样效应因子核酸酶(transcript1nactivator-1 ike effectornuclease,TALEN)技术、锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)和成簇规律间隔短回文重复(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat ,CRISPR)技术是目前基因组编辑领域的三大技术。目前，TALEN和ZFN是发展比较成熟的两种定点突变技术，但是，这两种技术在构建载体过程可识别特异位点的核酸酶较为繁琐，每一个位点需要构建两个相应的核酸酶。
【发明内容】
[0003]基于【背景技术】存在的技术问题，本发明提出了一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法。
[0004]本发明提出了一种以CRI SPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法，包括以下步骤:
[0005]SI，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将香味基因各个外显子及内含子处能被Cas9识别的序列打靶，然后对基因组DNA序列切割后引发DNA修复，从而产生缺失突变，获得功能缺失的Badh2基因；
[0006]S2，将粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用成熟胚、幼穗和子房等为外植体诱导获得二倍体愈伤组织，用花药、花粉和未受精子房等为外植体诱导获得单倍体愈伤组织，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞；
[0007]S3，将打靶载体导入到二倍体愈伤组织的细胞中，筛选阳性愈伤，分化成苗，鉴定遗传转化阳性植株，从Tl群体分离得到香稻品系;将打靶载体导入到单倍体愈伤组织的细胞中，筛选阳性愈伤，用秋水仙素加倍，分化成苗，鉴定遗传转化阳性植株，最终得到香稻品系O
[0008]优选的，所述基因敲除靶点应设在起始密码子附近或其下游的外显子区域，靶序列一般由19个碱基构成，靶序列前面必须是碱基G作为转录的起始信号，而靶序列末端的PAM序列必须是NGG，且靶序列必须具有唯一性。
[0009]优选的，将所述构建好的载体质粒DNA利用农杆菌感受态EHA105转化到农杆菌，并抽质粒验证表达载体的目的片段。
[0010]优选的，所述粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，获得香味水稻植株，以下以鄂早17为例:
[0011](I)以鄂早17成熟胚，幼穗和子房等外植体的愈伤组织(二倍体)为受体，将打靶载体利用农杆菌介导法转入到二倍体受体细胞中，经过筛选后再分化成苗，从Tl群体中筛选出纯合的带香味的植株。
[0012](2)以鄂早17为材料进行花药，花粉和未受精子房等外植体愈伤组织(单倍体)为受体材料，利用农杆菌介导法将香味基因Badh2的打靶载体导入到单倍体愈伤组织中，用潮霉素筛选后，利用秋水仙素加倍处理，再分化成植株，这样得到带有香味基因的纯合二倍体植株。
[0013]本发明中提到的CRISPR/Cas9是第三代基因编辑技术，其工作原理是细菌抵御降解入侵的噬菌体等外源DNA时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。CRISPR/Cas9系统每个针对特异位点的crRNA只有十几个碱基，整个载体较小。而TALEN和ZFN技术操作比较繁琐，成本昂贵，特别是TALEN技术在构建过程中需要大量的分子克隆和测序操作，一般实验室都无法操作。而CRISPR/Cas9系统只需要设计打靶位点，设计两条单核苷酸链，与需要打靶的目的片段进行替换，构建相应的载体即可。此技术不仅具有可拓展性，而且构建载体的过程只需要几步就可以完成，操作简单方便，一般实验室都可操作，本发明不仅以传统的外植体愈伤组织为受体材料，同时还以花药，未受精子房等外植体的愈伤组织(单倍体)为受体材料，将外源基因转化后加倍即可得到纯合的阳性植株，与常规的杂交育种方法相比，该方法大大节省了人力物力以及时间成本。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
[0015]本发明提出的一种以CRI SPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法，包括以下步骤:
[0016]S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将香味基因各个外显子及内含子处能被Cas9识别的序列打靶，然后对基因组DNA序列切割后引发DNA修复，从而产生缺失突变，获得功能缺失的Badh2基因；
[0017]S2、将粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用成熟胚、幼穗和子房等为外植体诱导获得二倍体愈伤组织，用花药、花粉和未受精子房等为外植体诱导获得单倍体愈伤组织，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞；
[0018]S3、将打靶载体导入二倍体愈伤组织细胞，筛选、鉴定阳性植株，从Tl群体分离得到香稻品系；将打靶载体导入到单倍体愈伤组织的细胞中，筛选阳性愈伤，用秋水仙素加倍，分化成苗，鉴定遗传转化阳性植株，最终得到香稻品系。
[0019]本发明中，所述基因编辑的靶序列应设在起始密码子附近或其下游的外显子中，靶序列一般由19个碱基构成，靶序列前面必须是碱基G作为识别起始信号，而靶序列后面的PAM序列必须是NGG，且靶点序列必须具有唯一性;将所述构建好的载体质粒DNA利用农杆菌感受态EHA105转化到农杆菌，并抽质粒验证表达载体的目的片段。
[0020]本发明中，所述粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，获得香味水稻植株，以下以鄂早17为例:
[0021](I)以鄂早17成熟胚，幼穗和子房等外植体的愈伤组织(二倍体)为受体，将打靶载体利用农杆菌介导法转入到二倍体受体细胞中，经过筛选后再分化成苗，从Tl群体中筛选出纯合的带香味的植株。
[0022](2)以鄂早17为材料进行花药，花粉和未受精子房等外植体愈伤组织(单倍体)为受体材料，利用农杆菌介导法将香味基因Badh2打靶载体导入到单倍体愈伤组织中，用潮霉素筛选后，利用秋水仙素加倍处理，再分化成植株，这样得到带有香味的纯合二倍体植株。
[0023]遗传转化技术又称为转基因技术，是20世纪70年代从分子遗传学基础上发展起来的一门新技术，它是应用DNA重组技术，综合采用了物理，化学以及生物学技术有目的的将外源基因或DNA片段导入到受体植物的细胞中。目前，应用比较广泛的主要有农杆菌介导法和基因枪法，农杆菌介导法在植物转基因技术上有广泛的应用，该方法在导入外源DNA片段时在结构上是完整的，转化效率较高，技术操作相对简单。而基因枪法转化成本较高，如果外源片段DNA较大时则很难通过该方法转移，所以农杆菌介导法是目前植物遗传转化的首选，作为水稻遗传转化的受体材料，传统方法都是以成熟胚，子房和幼穗外植体的二倍体愈伤组织为受体材料，虽然转化效率较高，但后代需要自交才能分离出阳性植株，时间成本尚O
[0024]本发明中利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Badh2基因，与TALEN和ZFN技术相比，操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作，而且用农杆菌介导法将香味基因Badh2打靶载体分别导入到二倍体和单倍体细胞组织中，与常规的杂交育种相比，大大节约了时间成本，是一种新的获得香稻品系的分子育种方法。
[0025]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法，其特征在于，包括以下步骤: SI，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将香味基因各个外显子及内含子处能被Cas9识别的序列打靶，然后对基因组DNA序列切割后引发DNA修复，从而产生缺失突变，获得功能缺失的Badh2基因； S2，将粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料:用成熟胚、幼穗和子房等为外植体诱导获得二倍体愈伤组织，用花药、花粉和未受精子房等为外植体诱导获得单倍体愈伤组织，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞； S3，将打靶载体导入到二倍体愈伤组织的细胞中，筛选阳性愈伤，分化成苗，鉴定遗传转化阳性植株，从Tl群体分离得到香稻品系;将打靶载体导入到单倍体愈伤组织的细胞中，筛选阳性愈伤，用秋水仙素加倍，分化成苗，鉴定遗传转化阳性植株，最终得到香稻品系。2.根据权利要求1所述的一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法，其特征在于，所述基因敲除靶序列应设在起始密码子附近或其下游的外显子区域，靶序列一般由19个碱基构成，靶序列前面必须是碱基G作为转录的起始信号，而靶序列后面的PAM序列必须是NGG，且靶序列必须具有唯一性。3.根据权利要求1所述的一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法，其特征在于，将所述构建好的载体质粒DNA利用农杆菌感受态EHA105转化到农杆菌，并抽质粒验证表达载体的目的片段。4.根据权利要求1所述的一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法，其特征在于，所述粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，获得香味水稻植株。
【专利摘要】本发明公开了一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术打靶Badh2基因获得香稻品系的方法，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将香味基因各个外显子及内含子处能被Cas9识别的序列打靶，然后对基因组DNA序列切割后引发DNA修复，从而产生缺失突变，获得功能缺失的Badh2基因。将籼稻、粳稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料：用成熟胚、幼穗和子房等为外植体诱导获得二倍体愈伤组织，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞，筛选、鉴定阳性植株，从T1群体分离得到香稻品系；用花药、花粉和未受精子房等为外植体诱导获得单倍体愈伤组织，用农杆菌介导法将打靶载体导入到愈伤组织的细胞中，筛选阳性愈伤，用秋水仙素加倍，分化成苗，鉴定遗传转化阳性植株，最终得到香稻品系。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105505979
【申请号】CN201510856814
【发明人】居超明, 邓燕, 徐国成, 吴文华
【申请人】湖北大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年11月28日