后根据该目标DNA片段合成出能识别该片段的gRNA。
[0042] 实施例1原理如图2和图3所示，实验结果如图18所示。首先，我们将gRNA识别 序列构建到SSA载体中，然后在真核表达载体上构建gRNA表达载体；其次，我们将gRNA表 达载体、cas9表达载体、SSA表达载体共转染到HEK293T细胞中，24小时之后检查荧光素酶 基因的表达水平。同时，我们将gRNA表达载体和cas9表达载体共转染到HEK293T细胞中， 48小时之后，提取基因组DNA，做SURVEYOR实验，反应gRNA/cas9活性。从图18中可以看 出，gRNAl的活性相对gRNA活性提高50 %左右。
[0043] 实施例2实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA2。实验结果见 图19。由图19可以看出，gRNA2的活性相对gRNA活性提高了 30%左右。
[0044] 实施例3实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA3。实验结果见 图20。由图20可以看出，gRNA3的活性相对gRNA活性提高了 30%左右。
[0045] 实施例4实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA4。实验结果见 图21。由图21可以看出，gRNA4的活性相对gRNA活性提高了 60%左右。
[0046] 实施例5实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA5。实验结果见 图22。由图22可以看出，gRNA5的活性相对gRNA活性提高了 60%左右。
[0047] 实施例6实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA6。实验结果见 图23。由图23可以看出，gRNA6的活性相对gRNA活性提高了 30%左右。
[0048] 实施例7实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA7。实验结果见 图24。由图24可以看出，gRNA7的活性相对gRNA活性提高了 40%左右。
[0049] 实施例8实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA8。实验结果见 图25。由图25可以看出，gRNA8的活性相对gRNA活性提高了 100%左右。
[0050] 实施例9实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNA9。实验结果见 图26。由图26可以看出，gRNA9的活性相对gRNA活性提高了 110%左右。
[0051] 实施例10实验过程与实施例1类似，只是将gRNAl序列换成了gRNAlO。实验结果 见图27。由图27可以看出，gRNAlO的活性相对gRNA活性提高了 45%左右。
[0052]由上述实施例的结果可以看出，gRNAl、gRNA2、gRNA3、gRNA4、gRNA5、gRNA6、gRNA7、 gRNA8、gRNA9和gRNAlO在SSA实验中还是在SURVEYOR实验中都可以有效的对目标DNA序 列进行剪切，体现出相对gRNA较高的活性。
[0053] 附录
[0054] (1)
[0055] gRNA识别序列（AATAACAGTGATAAITTCT)
[0056] gRNA碱基序列：
[0057] AAUAACAGUGAUAAUUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC UUGAAAAA⑶GGCACCGA⑶CG⑶GCU
[0058] (2)
[0059] gRNA识别序列（CAGTGATAAITTCTGGGITA)
[0060] gRNA碱基序列：
[0061] CAGUGAUAAUUUCUGGGUUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA⑶CCGUUAUCAA CUUGAAAAA⑶GGCACCGA⑶CG⑶GCU
[0062] (3)
[0063] gRNA识别序列（AGGGCGAGGAGCTGITCACC)
[0064] gRNA碱基序列：
[0065] AGGGCGAGGAGCUGUUCACCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUA⑶CCGUUAUCAA CUUGAAAAA⑶GGCACCGA⑶CG⑶GCU
[0066] (4)
[0067] Cas9氨基酸序列：
[0068] MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTAR RRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDST DKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIE⑶LNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLE NLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQI⑶QYADLFLAAKNLSDAI LLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIK PILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGP LARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVT EGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLD NEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGffGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKS DGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIE MARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVD HIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGF IKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVV GTALIKKYPKLESEFVY⑶YKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSN MNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETG EIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVA KVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGN ELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKP IREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
[0069] (5)
[0070] SSA质粒核心碱基序列：
[0071]ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTATCCTCTAGAGGATGGAACCGCTGGA GAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGAACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGT GAACATCACGTACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAA ATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTT GCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGT GTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTATCA TGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAAT GAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGGATCTACTGG GTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATAGAACTGCCTGCGTCAGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCA ATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGA TATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTACGATCCCTTCAGGATTA CAAAATTCAAAGTGCGTTGCTAGTACCAACCCTATTTTCATTCTTCGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATT TATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCAAAACGCTTC CATCTTCCAGGGATACGACAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACATCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGA TAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGG GCGTTAATCAGAGAGGCGAATTATGTGTCAGAGGACCTATGTGAAGATCTGTTATTTTCTCCCCTAAGGATCCTGCG GGCATTTTTGAGCTGGTGGACTCGAGCGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCC TACCGTAGTGTTTGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAA TTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCC GGTTTTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCGTGACAAAACAATTGCACTGATAATGAATTCCTCTGG ATCTACTGG