一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化转氨酶，该固定化转氨酶的 制备方法，以及该固定化转氨酶作为催化剂在不对称合成西他列汀中间体中的应用。
【背景技术】
[0002] 酶是一类由生物体产生的具有催化功能的生物大分子物质，作为一种生物催化 剂，酶在常温常压的温和条件下能催化各种有机化学反应。酶催化具有高效性，比一般催化 剂的效率高出IO 7~10 13倍；酶催化具有很高的专一性，可以减少或避免副反应，得到很高 纯度的产物；酶催化反应还具有很高的立体选择性和区域选择性，无需保护与脱保护。酶的 这些优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研宄。但是，由于酶绝大多数属于蛋白质， 其高级结构对环境十分敏感，各种因素如物理因素（温度、压力、电磁场等）、化学因素（氧 化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、PH等）和生物因素（酶修饰和酶降解等）均有可 能使其丧失生物活性。即使在最适条件下，酶也会逐渐失活，随着反应时间的延长，反应速 度会逐渐下降；此外，反应后酶不能回收，只能采用分批法进行生产，这对于现代生物催化 工业来说，成本较高。
[0003] 为了解决以上问题，人们设计了一种固定化酶，就是将酶束缚于某种特殊的介质 中，使它与反应体系分开，但仍能与底物进行分子交换。这种固定化酶与一般的固体化学催 化剂一样，既具有催化特性，又具有能回收、反复使用等优点，生产工艺也可以实现连续化、 自动化。
[0004] 固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法与共价结合法。其中，吸附法 又可以分为物理吸附法与离子吸附法两种，该方法条件温和，酶活损失少，易于再生，但是 固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺、尼龙膜或 硝酸纤维素微囊包埋，该方法一般较为温和，酶活性损失少，但是传质阻力很大，不利于较 大分子或很低溶解度底物的催化。交联法中用的最多的是戊二醛交联，一般操作较为简便， 但是反应剧烈，酶活损失大；而且机械性能差，颗粒度细，难以分离。共价结合法常用芳胺 载体的重氮化反应、羟基载体的溴化氰-亚胺碳酸盐反应、羧基载体的羰二亚胺反应、巯基 载体的二硫键交换反应等，由于其结合牢固、稳定性好等特点，是目前研宄与应用最为广泛 的一类方法。但是该方法条件苛刻，反应剧烈，酶活损失大（一般残余酶活在30%左右）。
[0005] 西他列汀磷酸盐由默克公司开发，于2006年8月及10月分别被墨西哥卫生部及 美国FDA批准为治疗II型糖尿病的药物，商品名为捷诺维（Januvia)，目前已经在全世界 60多个国家批准使用，2012年销售额已达40. 86亿美元，同比增长23%。因此，西他列汀磷 酸盐是属于国际最新且附加值极高的"重镑炸弹"，其合成的关键是手性胺中心的构建。
[0006] 美国专利US8293507公开了 Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶进行改造得到的 生物催化剂来构建手性胺中心，转氨化产物ee值达到99%，底物投料100g/L。但是由于底 物水溶性差，需要添加高达50%的DMSO助溶，使得产品的后处理损失较大，DMSO的溶剂残 余较高，回收困难，成本较高。
[0007] 而后默克公司在中国专利申请CN103608355A中公开了利用环氧树脂对该酶进行 固定化，使得反应得以在水饱和的乙酸异丙酯中进行反应，但是并未公布该酶进行固定化 的酶活回收率。
[0008] 中国专利申请CN10301408IA公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-羰 基-4- (2, 4, 5-三氟苯基）-丁酸甲酯转化为R-3-氨基-4- (2, 4, 5-三氟苯基）-丁酸甲酯， 但是并没有公开具体转氨酶的序列以及克隆方法。
[0009] 中国专利申请号201410169882. 4公开了本公司运用来源于分支杆菌 (Mycobacterium vanbaalenii) PYR-I 的转氨酶对 3-幾基-4-(2, 4, 5-三氟苯基）-丁酸甲 酯的不对称转氨化反应，由于该底物水溶性较高，因此具有较高的时空产率，具有一定的工 业化应用价值。但是，游离酶反应使得分离困难，不能重复利用。
【发明内容】
[0010] 本发明针对来源于分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii)PYR-I的转氨酶在酶 催化过程中分离困难，以及酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，将海 藻酸钠与带组氨酸标签的分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii)PYR-I来源的转氨酶进 行固定化，并用氯化钙溶液进行处理得到固定化转氨酶。该固定化方法反应温和，酶活基 本无损失。运用该固定化酶对底物3-羰基-4-(2, 4, 5-三氟苯基）-丁酸甲酯进行不对称 转氨，可以重复利用20批次，且分离简单。
[0011] 本发明的第一方面提供了 一种固定化转氨酶。
[0012] 该固定化转氨酶是将将重组转氨酶固定于海藻酸钠上得到的。
[0013] 在一个特定的实施方案中，所述重组转氨酶是中国专利申请CN201410262154. 8 中记载的带有组氨酸标签的来源于分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii)PYR-I的转氨 酶；其中，所述来源于分支杆菌PYR-I的转氨酶由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列编码。
[0014] 本发明的第二方面提供了上述固定化转氨酶的制备方法。
[0015] 将表达重组转氨酶的工程菌细胞与5倍质量的水高压均质，破胞得到粗酶液；将 粗酶液与海藻酸钠混合均匀，加入1 % (v/v)的戊二醛，摇床震荡30分钟，然后静置3小时， 得到混合溶液；将该混合溶液滴入2% (w/v)的氯化钙溶液中形成凝胶小球，过滤洗涤得到 固定化转氨酶。
[0016] 优选地，在粗酶液中加入I. 5% (w/v)的海藻酸钠；所述洗涤步骤为用0. 9% (w/ v)的氯化钠溶液洗绦2遍。
[0017] 本发明所述的固定化转氨酶的制备方法的原理如图1所示。
[0018]
[0019] 本发明的第三方面是提供了本发明的固定化转氨酶在催化前手性羰基化合物进 行不对称转氨反应形成光学活性手性胺中的应用。
[0020] 上述应用中，所述的不对称转氨反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进 行选择，优选如下：
[0021] 所述的转氨酶优选本发明的固定化转氨酶。
[0022] 所述的前手性羰基化合物较佳地为1-(2, 4, 5-三氟苯基）-4_取代-2, 4- 丁二酮 类化合物，即是式I所示的化合物：
[0023]
【主权项】
1. 一种固定化转氨酶，其特征是将重组转氨酶固定于海藻酸钠上得到的。
2. 根据权利要求1所述的固定化转氨酶，其中所述重组转氨酶是带有组氨酸标签的来 源于分支杆菌（Mycobacterium vanbaalenii)PYR_l 的转氨酶。
3. 根据权利要求2所述的固定化转氨酶，其中，所述来源于分支杆菌PYR-1的转氨酶由 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列编码。
4. 权利要求1-3任一项所述的固定化转氨酶的制备方法，其特征在于：将表达所述重 组转氨酶的工程菌细胞与5倍质量的水高压均质，破胞得到粗酶液；将粗酶液与海藻酸钠 混合均匀，加入1% (v/v)的戊二醛，摇床震荡30分钟，然后静置3小时，得到混合溶液；将该 混合溶液滴入2%(w/v)的氯化钙溶液中形成凝胶小球，过滤洗涤得到固定化转氨酶。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其中，在粗酶液中加入1. 5%(w/v)的海藻酸钠。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述洗涤步骤为用0. 9% (w/v)的氯化钠溶液 洗涤2遍。
7. 权利要求1-3任一项所述的固定化转氨酶在催化前手性羰基化合物进行不对称转 氨反应形成光学活性手性胺中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其中所述的前手性羰基化合物选自以下化合物：
其中，R选自 烷氧基； 芳氧基；或
钟， X 选自（1) N，和（2) CR2; R1和R2独立地选自： (1) H； (2) CN； (3) 直链或支链且未被取代或被1~5个卤素原子取代的C1-C10烷基。
9. 根据权利要求8所述的应用，其中R为碳链长度为1~8的烷氧基、苄基或
10. 根据权利要求9所述的应用，其中R为-CH 3、_012013或
11. 根据权利要求7-10任一项所述的应用，其包括在pH 7. 0~10. 0的磷酸-磷酸钠 缓冲溶液中，在5%(v/v)~50%(v/v)乙醇、20~100g/L的异丙胺和0. 1~1. Ommol/L磷酸 P比口多醛（PLP)的存在下，50~300g/L所述固定化转氨酶催化10~60g/L的所述前手性羰 基化合物进行不对称转氨反应，形成光学活性手性胺。
【专利摘要】本发明提供了一种固定化转氨酶，该转氨酶是重组转氨酶固定于海藻酸钠上得到的。本发明的固定化转氨酶结合牢固、酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。
【IPC分类】C12N11-04, C12P13-00, C12N11-10
【公开号】CN104805069
【申请号】CN201510063978
【发明人】罗煜, 丁时澄, 瞿旭东, 郭锋
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年2月6日