一种葡萄球菌裂解酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制剂领域，具体涉及一种能杀灭葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球 菌裂解酶及其在葡萄球菌杀灭、检测等方面的应用。
【背景技术】
[0002] 根据生化反应和产生色素不同，葡萄球菌可分为金黄色葡萄球菌 (staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis)和腐生葡萄球 菌（staphylococcus saprophytics)等三种。其中金黄色葡萄球菌多为致病菌，表皮葡萄 球菌偶尔致病，腐生葡萄球菌一般不致病。金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus)是 一种常见的革兰氏阳性球菌，能引起人和动物的许多严重的感染，同时也是医院感染常见 的病原体之一。葡萄球菌易于对抗生素产生抗性，包括常见的各种抗生素，以及新型的抗微 生物制剂。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)的出现和广泛传播给临床治疗带来了前所 未有的挑战。为了应对葡萄球菌的耐药性问题，常需要提取葡萄球菌基因组DNA，用于PCR 检测临床菌株是否是MRSA等等。然而，由于葡萄球菌细胞壁坚厚，常规的蛋清溶菌酶对其 没有明显的溶壁作用，而具有良好溶壁效果的溶葡萄球菌素价格昂贵，难以普遍应用。
[0003] 噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶。 裂解酶大小通常为25kD~40kD，在结构上由两个独立的功能域构成，N-端的催化功能域， 和一个决定细胞结合位点的C-端细胞壁结合功能域（CBD)，二者之间由一个小片段链接。 序列分析表明，同一类裂解酶的催化域高度保守，而细胞结合域可变，这为构建新的嵌合裂 解酶提供了可能。裂解酶具有很高的特异性，只能特异性的识别和裂解特定种类的细菌。 此外，裂解酶作用位点很保守，加上噬菌体与细菌共同进化的特异性，宿主菌很难对其产生 抗性。裂解酶的这些特点，为其用于临床上耐药细菌的控制和治疗提供了理论的可行性。 到目前为止，已有一些能作用于金黄色葡萄球菌的天然裂解酶以及嵌合裂解酶被报道，这 些酶可以在体内、体外较好地杀灭金黄色葡萄球菌。但是这些裂解酶大多比较难于可溶性 表达，或者活性不高，或者不能适应高蛋白环境（如牛奶等），作用pH范围较窄，一般在pH 5-8。寻找能可溶、大量表达以及高活性的裂解酶对于开发新的抗葡萄球菌的药物，体外控 制葡萄球菌的感染，裂解葡萄球菌的细胞壁用于检测等等都具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种可溶表达、活性高的葡萄球菌裂解酶及其 应用。该种裂解酶能在体外、体内杀灭葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌。为了叙述方便， 我们命名为ClyO,其编码基因为ClyO。
[0005] 本发明提供的葡萄球菌裂解酶的编码基因 ClyO的核酸序列如序列表中SEQ. ID. NO. 1 所示。
[0006] 本发明提供的葡萄球菌裂解酶ClyO的蛋白序列如序列表中SEQ. ID. NO. 2所示。
[0007] 本发明还公开了一种可溶表达ClyO蛋白质及纯化的方法，其步骤为：将ClyO基因 克隆后连入表达载体PBAD24中，然后将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，所 表达的蛋白质先经过离子交换纯化，再用磷酸盐（PBS)缓冲液透析处理。
[0008] 本发明证实了该裂解酶ClyO的高活性与对葡萄球菌的广谱性。本发明公开了 ClyO体外杀灭表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马胃葡萄球菌、头葡萄球菌、白色葡萄球菌、木 糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、产色葡萄球菌、以及金黄色葡萄球菌的用途。 所述金黄色葡萄球菌包括临床分离的甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌和甲氧西林耐药的 金黄色葡萄球菌。本发明还初步试验了 ClyO对实验动物模型小鼠感染金黄色葡萄菌后的 保护效果，以及对细胞毒性的测试，初步证实了其用于制备治疗葡萄球菌感染药物的潜能。
[0009] 本发明还进一步公开了裂解酶ClyO在葡萄球菌检测和鉴定中的用途。用裂解酶 ClyO与待测细菌作用后，释放菌内的三磷酸腺苷（ATP)或DNA等胞内物质，通过检测释放的 ATP或DNA来用于葡萄球菌的检测和鉴定。
[0010] 本发明还进一步公开了利用ClyO快速裂解葡萄球菌细胞壁并释放胞内ATP的特 点，采用荧光素酶检测释放的ATP来进行葡萄球菌的快速鉴定的方法。其步骤为：将待测细 菌与ClyO混合后，加入荧光素酶及其底物于37摄氏度孵育，同时用酶标仪检测混合液发光 强度的变化，同时用没有加入ClyO的菌混合液作为阴性对照。
[0011] 本发明还进一步公开了利用ClyO快速裂解葡萄球菌细胞壁并释放胞内DNA的特 点，以裂解液中释放的DNA为模板，采用PCR方法对葡萄球菌进行各种检测和鉴定的方法。 作为例子，提供了用于MRSA鉴定和分型的检测结果。其步骤为：将待测细菌与ClyO混合 后于37摄氏度孵育10-15min，对混合液1000 Og离心lmin。取上清做模板，加入MRSA鉴定 的两对引物（分别针对femB和mecA)进行PCR来对菌株是否为MRSA进行鉴定；对鉴定为 MRSA的菌株，则进一步加入SCCmec分型所需的5对引物进行PCR，对MRSA菌株进行分型。
[0012] 本发明的裂解酶具有以下的突出效果和优点：
[0013] ClyO能在体内、体外杀灭各种葡萄球菌，包括多种临床分离的金黄色葡萄球菌和 耐药金黄色葡萄球菌（MRSA)菌株；ClyO细胞毒性低，具有应用于体内作为抗感染药物的 潜能；ClyO能采用大肠杆菌可溶性表达，适合于今后的发酵生产；ClyO的酶活性高，且在 PH4-11的范围内都具有较高活性。
[0014] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。
【附图说明】
[0015] 图1为ClyO基因的PCR扩增结果。图中M泳道为标准分子量marker，个条带的大 小标记在其左侧。0泳道为所扩增ClyO的条带。
[0016] 图2. ClyO杀灭金黄色葡萄球菌标准菌株CCTCC AB91118的结果。虚线所示为金 黄色葡萄球菌与ClyO混合后0D600随时间的变化趋势，实线所示为金黄色葡萄球菌与缓冲 液混合后0D600随时间的变化趋势。空心圆圈所示为金黄色葡萄球菌与缓冲液混合后对数 值（LogCFU)随时间的变化趋势。
[0017] 图3. ClyO体外杀灭多种葡萄球菌以及对不同种类菌株特异性的结果。纵坐标表 示将不同菌株与ClyO混合后37摄氏度孵育30min，0D600降低的速率。
[0018] 图4. ClyO在牛奶中杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)菌株的结果。纵坐标 表示将不同菌株与ClyO混合后37摄氏度孵育60min后细菌数目降低的对数值。
[0019] 图5为ClyO清除小鼠烫伤皮肤组织上感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA) 的结果。每组20只小鼠，在烫伤的皮肤组织上分别接种高浓度的MRSA，24小时后分别用 PBS以及IOOmg ClyO处理。处理24小时后切下皮肤组织，稀释平板计算单位皮肤组织中的 细菌载量。对照组为接种细菌后不做任何处理。
[0020] 图6为ClyO体内杀灭金黄色葡萄球菌的结果。每组20只小鼠，分别注射致死剂 量的金黄色葡萄球菌后，实验组于3小时后腹腔注射Img ClyO。对照组于3小时后腹腔注 射等体积的PBS溶液。每天观测各组小鼠的存活率。
[0021] 图7为ClyO对于细胞毒性的测试结果。分别用浓度为0. 1，0.5和lmg/ml的ClyO 作用于Caco-2细胞没有观察到明显的细胞毒性。其中离子霉素和丝裂霉素 C为对细胞有 毒性的阳性对照。
[0022] 图8为ClyO用于基于ATP释放的葡萄球菌快速检测结果。图中黑色直线代表空 白对照，上升的曲线代表不同的金黄色葡萄球菌菌株。
[0023] 图9为ClyO用于MRSA鉴定的PCR检测结果。三角所示位置为femB基因，星号 所示位置为mecA基因。同时具有femB基因和mecA基因的为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA。只具有femB基因的为甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌MSSA。只具有mecA基因的为 金黄色葡萄球菌的其它菌株。
[0024] 图10为ClyO用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA)分型的PCR检测结果。 SCCmec I型菌株PCR所得条带应为415bp。SCCmec II型菌株PCR所得条带应为937bp。 SCCmec III型菌株PCR所得条带应为518bp。SCCmec IV型菌株PCR所得条带应为415bp 和937bp的两条带。SCCmec V型菌株PCR所得条带应为518bp和359bp的两条带。
[0025] 图11为ClyO用于模拟皮肤消毒后降低皮肤表面葡萄球菌的数目。当接种量 〈100CFU时，用ClyO处理后能完全消除。
【具体实施方式】
[0026] 通过对葡萄球菌噬菌体裂解酶的催化域和细胞结构域氨基酸序列的分析，本发明 设计和人工合成了能表达一种葡萄球菌裂解酶ClyO的基因序列，并通过体外重组到大肠 杆菌中表达，获得了该酶。下列实施例中所用的方法如无特别说明均是常规的实验方法。实 验中所用到的引物均由上海英骏公司合成。测序均在上海英骏公司完成。所采用的金黄色 葡萄球菌标准菌株CCTCC AB91118购自武大菌株保藏中心，表皮葡萄球菌ATCC 12228、参 考菌株购于广东微生物保藏中心、其它均为临床分离菌株，来源于武汉的几个医院，并经过 美国Biolog自动微生物鉴定仪鉴定。临床菌株的耐药性经过甲氧西林纸片稀释法进行培 养验证。临床分离的金葡菌均在baird-parker琼脂基础（购自广东环凯微生物科技有限 公司）上划线分离，然后挑单菌落于TSB培养基中过夜培养，供测试。
[0027] 实施例1、能杀灭葡萄球菌的裂解酶的构建。
[0028] (1)在上海生工生物工程有限公司全序列合成能表达裂解酶ClyO的ClyO基因 DNA序列。合成序列装入pUC57质粒中。以ClyO基因为模板，在目的基因的两端分别加入 NcoI和XhoI的酶切位点，引物设计如下：
[0029] 正向引物：5~TTAACCATGGGCATGGCACTGCCTAAAACG~3 (SEQ. ID. NO. 3)
[0030] NcoI
[0031] 反向引物：5~ATATCTCGAGTTTAAATGTACCCCAAGC~3 (SEQ. ID. NO. 4)
[0032] XhoI
[0033] 以2μ I基因为模板，各加入引物Iyg进行PCR扩增，PCR扩增程序如下：1) 94°C， 5min ;2)94°C，30sec，62°C，45sec，72°C，45sec，30 个循环；3)72°C，IOmin ;将产物进行凝胶 电泳回收，电泳图谱如图l，ClyO的基因大小为777bp。与所设计的裂解酶基因片段的大小 一致。
[0034] (2)将C