lyO基因连入表达质粒pBAD24中得到重组载体pB-ClyO,然后将其转化大 肠杆菌 BL21(DE3)。
[0035] (3) ClyO的表达纯化。
[0036] 将表达菌株BL21 (DE3)/pB-Cly0用0. 2%的L-阿拉伯糖低温诱导表达。收集菌体 后超声破碎，取上清用33%硫酸铵沉淀，将沉淀溶于PBS后于PBS中透析过夜。透析液即有 明显的杀菌活性。
[0037] 透析后的粗提液，或者是超声后的上清，过HiTrap Q Sepharose FF column (GE Healthcare)，收集柱流出物。将柱流出物过HiTrap SP Sepharose FF column，然后用IM 的NaCl梯度洗脱，分段收集洗脱峰。将有活性的各管混合后于PBS中透析过夜，即为纯化 后的酶液。
[0038] 实施例2、ClyO杀灭金黄色葡萄球菌标准菌株CCTCC AB91118的验证
[0039] 将金黄色葡萄球菌过夜培养物，离心收集后用磷酸缓冲液（PBS)洗涤一次，再重 悬于PBS溶液中。取一定量的ClyO与上述菌液混合，同时用酶标仪监测混合液在600nm吸 收值的变化。用缓冲液与金黄色葡萄球菌的混合液作为负对照。最后得到的裂解曲线见图 2。 同时，在处理不同时间后稀释平板计算活菌数目。结果显示ClyO能快速的裂解CCTCC AB91118菌株，导致菌液的浊度降低，表现为菌液在600nm波长的吸收值快速降低。
[0040] 实施例3、ClyO体外多种葡萄球菌以及对不同种类菌株特异性的验证。
[0041] 为了验证ClyO的杀菌谱，我们选择了几种发明者实验室保存的非葡萄球菌菌株 和临床分离的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马胃葡萄球菌、松鼠葡萄球 菌、溶血性葡萄球菌、产色葡萄球菌以及其它菌株一起测试。首先将测试的菌株分别过夜培 养，离心收集后用PBS洗涤一次，然后重悬于PBS中。取一定量的ClyO与上述菌液分别混 合，同时用酶标仪监测混合液在600nm吸收值的变化30min。用OD 6tltl降低的速率表示不同 菌株的裂解效果。同时，用缓冲液与菌液的混合液作为负对照。试验得到的杀灭效果见图 3。 结果显示ClyO能快速的杀灭临床分离的多种葡萄球菌而对其它种类的测试菌株没有裂 解作用。
[0042] 实施例4、ClyO在牛奶中杀灭多种葡萄球菌菌株的效果。
[0043] 将临床分离得到的多型MRSA菌过夜培养，离心收集后用PBS洗涤一次后，重悬于 无菌巴氏消毒奶中。取一定量的ClyO与上述菌液分别混合后在37度放置60min，然后稀释 平板计算其中的活菌数目。试验得到的杀灭效果见图4。结果显示ClyO能在牛奶中快速的 杀灭多种葡萄球菌菌株。
[0044] 实施例5、ClyO清除小鼠烫伤皮肤组织上感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的效果。
[0045] 实验中所用小鼠为6周大的BALB/c雌性鼠，重约20到22克。在实验小鼠（60只） 背部用80度的开水处理IOs造成皮肤烫伤。之后在烫伤这种上接种I X IO7的MRSA菌株。 24小时后，将小鼠分为三组，每组20只。实验组小鼠分别用无菌PBS，或者IOOmg ClyO处 理，对照组则不做任何处理。24小时后计算单位烫伤皮肤组织中的细菌载量，所得到的结果 见图5。结果显示ClyO能有效降低烫伤皮肤组织中MRSA菌的载量。
[0046] 实施例6、ClyO体内杀灭金黄色葡萄球菌的验证。
[0047] 实验中所用小鼠为6周大的BALB/c雌性鼠，重约20到22克。在实验小鼠（40只） 腹腔注射6 X IO7金黄色葡萄球菌临床分离菌株WHSl 1081。3小时后，将小鼠分为两组，每组 20只。实验组小鼠腹腔注射ClyO lOOOyg，对照组则注射PBS缓冲液。每天观测小鼠的存 活率，所得到的结果见附图6。结果显示ClyO能有效的杀灭体内的金黄色葡萄球菌，从而提 高小鼠的存活率。
[0048] 实施例7、ClyO细胞毒性的测试。
[0049] 将Caco-2细胞以每孔5 X IO3的浓度接种到96孔板中，培养24小时后，向孔板中 加入一定浓度的Cly0(0.1-lmg/mL)以及离子霉素（15mg/mL)和丝裂霉素 C(15mg/mL)。继 续培养24小时。培养结束后，向孔板中加入染色剂WST-8,静置后在酶标仪上读取450nm吸 光值。所得到的结果见图7。结果显示即使高浓度的ClyO也无细胞毒性，而作为阳性对照 的离子霉素和丝裂霉素均显示了较高的细胞毒性。
[0050] 实施例8、ClyO用于基于ATP释放的葡萄球菌快速检测
[0051] 将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的过夜培养物离心收集，用PBS洗涤沉淀一次后重 悬于PBS中。取一定量的ClyO与上述菌液混合，同时加入0. 25 μΜ的荧光素酶和5 μΜ的 荧光素底物（其中含有12. 5 μ M辅酶Α)。混匀后的反应液置于37度，用酶标仪监测发光强 度的变化。试验得到的鉴定结果见图8。结果显示所测试的金黄色葡萄球菌菌液都有不同 程度的发光，原因显然是由于ClyO能裂解金葡菌的细胞壁导致了胞内ATP的释放，荧光素 酶能利用所释放的ATP催化底物发光，而作为空白对照的大肠杆菌溶液，由于ClyO不能裂 解其细胞壁，没有ATP释放，从而表现为没有发光产生。
[0052] 实施例9、ClyO用于金黄色葡萄球菌MRSA菌株的PCR鉴定
[0053] 将临床分离的金黄色葡萄球菌过夜培养物离心收集后，用PBS洗涤沉淀一次后重 悬于PBS中。取一定量的ClyO与上述菌液混合，37摄氏度裂解10-15min。将裂解后的溶 液1000 Og离心lmin，取上清1 μ 1做模板，各加入引物1 μ g进行PCR扩增。扩增femB基因 所用引物为 FemB-F(5' -TTACAGAGTTAACTGTTACC-3'）（SEQ. ID. NO. 5)和 FemB-R(5' -ATACAA ATCCAGCACGCTCT-3'）（SEQ. ID.N0.6);扩增 mecA 基因所用引物为 MecA-F(5'-GTAGAAATGACT GAACGTCCGATAA-3'）（SEQ. ID. NO. 7)和 MecA-R(5'-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA-3'）（SEQ. ID. NO. 8)。PCR扩增程序如下：1) 94°C，5min ;2) 94°C，30sec，5(TC，45sec，72°C，60sec，30 个 循环；3)72°C，IOmin ;将产物进行凝胶电泳分析，电泳图谱如图9。femB基因大小为65Ibp， mecA基因为310bp。耐甲氧西林金葡菌（MRSA)应同时具有两个基因，甲氧西林敏感的金葡 菌（MSSA)应只有femB基因。只具有mecA基因的为金葡菌的其它菌株。结果显示用ClyO 作用金黄色葡萄球菌后的裂解液上清做模板，可以方便的用于PCR鉴定MRSA菌株。
[0054] 实施例10、ClyO用于MRSA分型的PCR鉴定的验证
[0055] 将临床分离的MRSA菌过夜培养物离心收集后，用PBS洗涤沉淀一次后重悬于PBS 中。取一定量的ClyO与上述菌液混合，37摄氏度裂解10-15min。将裂解后的溶液1000 Og 离心lmin，取上清1 μ 1做模板，各加入分型所需的引物1 μ g进行PCR扩增，PCR扩增程序 如下：l)94°C，5min ;2)94°C，30sec，5(TC，30sec，72°C，30sec，30 个循环；3)72°C，IOmin ;将 产物进行凝胶电泳分析，电泳图谱如图10。结果显示用ClyO作用后的裂解液上清做模板， 可以方便的用于MRSA的PCR分型鉴定。各种型别的MRSA菌株均能得到很好的鉴定。其中 分型所需的4对引物及各型的基因特征如下表所示。
[0056]
【主权项】
1. 一种能裂解葡萄球菌的裂解酶，其氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
2. 编码权利要求1所述裂解酶的基因，其核酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
3. 权利要求1所述的裂解酶可溶表达与纯化的方法，其特征在于，将权利要求2所述基 因克隆后连入表达载体PBAD24中，然后将表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达， 所表达的蛋白质先经过离子交换纯化，再用磷酸盐缓冲液透析处理。
4. 权利要求1所述的裂解酶在体外杀灭表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、马胃葡萄球菌、 头葡萄球菌、白色葡萄球菌、木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、产色葡萄球 菌、以及金黄色葡萄球菌的用途。
5. 根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌包括甲氧西林敏感 的金黄色葡萄球菌和甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌。
6. 权利要求1所述的裂解酶在作为治疗葡萄球菌感染药物中活性成分的用途。
7. 权利要求1所述的裂解酶在葡萄球菌检测和鉴定中的用途，其特征在于，用权利要 求1所述裂解酶与待测细菌作用后，释放菌内的ATP或DNA，通过检测释放的ATP或DNA来 用于葡萄球菌的检测和鉴定。
8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，将待测细菌与权利要求1所述裂解酶混合 后，加入荧光素酶及其底物于37摄氏度孵育，同时用酶标仪检测混合液发光强度的变化， 同时用没有加入权利要求1所述裂解酶的菌混合液作为阴性对照。
9. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于，将待测细菌与权利要求1所述裂解酶混 合后于37摄氏度孵育10-15 min，对混合液10000 g离心I min，取上清做模板，加入MRSA 鉴定的两对引物进行PCR来对菌株是否为MRSA进行鉴定；对鉴定为MRSA的菌株，则进一步 加入SCCmec分型所需的5对引物进行PCR，对MRSA菌株进行分型。
【专利摘要】本发明公开了一种能杀灭葡萄球菌的裂解酶及其应用，属于生物制剂领域。本发明公开了该酶的氨基酸序列和编码基因序列。该酶发挥作用的pH范围宽，在pH4-11都保持有裂解葡萄球菌的活力，采用编码基因构建的重组蛋白酶能在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶表达。该酶能用于在体外高效杀灭各种葡萄球菌，包括临床分离的甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌和甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌。该酶能用作治疗体内葡萄球菌感染的抗生素。所公开的酶也能快速裂解葡萄球菌的细胞壁并释放胞内的物质，如三磷酸腺苷和DNA等，利用所释放的物质来对葡萄球菌进行检测。
【IPC分类】C12Q1-66, C12Q1-527, A61P31-04, C12Q1-68, C12Q1-14, C12N9-88, C12N15-60, C12N15-70, A61K38-51
【公开号】CN104805066
【申请号】CN201510252947
【发明人】危宏平, 杨航, 余军平
【申请人】武汉赛思锐微生物技术有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月18日