一种水稻组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻组蛋白脱乙酰化酶及其编码基 因和应用。
【背景技术】
[0002] 植物在生长发育过程中常常会受到干旱、高盐、高温或寒冷等多种不利环境条件 的影响，这些不利因素在很大程度上限制着农作物的产量和种植分布，成了许多地区农业 发展的障碍。尽快培育出抗逆的作物品种并应用于生产已经成为农业科学技术研宄攻关的 重要方向。
[0003] 基因工程技术通过改变一个或几个基因的活性来提高植物的抗逆性，它是在基因 水平上进行的，具有精确性和稳定性，提高了育种的效率，极大地加快了育种进度。随着分 子生物学与基因工程技术的日趋成熟和迅猛发展，通过基因工程手段改良作物的抗性已经 受到越来越广泛的关注和重视。
[0004] 水稻是我国的主要粮食作物之一，提高水稻的抗逆性对保障我国粮食产量稳定具 有重要意义。缺水是水稻种植中最为常见的非生物胁迫之一，在许多地区是水稻种植的瓶 颈。利用基因工程技术，将抗旱基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而改良其抗旱 性，是培育出既抗逆又高产优质的农作物新品种的有效途径之一。
[0005] 真核生物细胞核中，基因组DNA由组蛋白以及其它一些蛋白共同组成了核蛋白复 合物，也就是常说的染色质。染色质的结构是高度动态的，并且能够被与其相关的一些蛋白 所调控。目前已知水稻中含有18个组蛋白脱乙酰化酶成员，可分为3大亚家族：RPD3/HDA1 亚家族14个成员、SIR2亚家族2个成员和HD2亚家族2个成员（Fu，et al. 2007)。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种可用于提高植物抗旱的组蛋白脱乙酰化酶 0sHDA705及其编码基因0sHDA705。
[0007] 所述的组蛋白脱乙酰化酶0sHDA705,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 编码上述组蛋白脱乙酰化酶0sHDA705的组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705,其特 征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1的第73位到1449位碱基序列所示。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种含有所述的组蛋白脱乙酰化酶基因0SHDA705的 重组表达载体。
[0010] 所述的表达载体为任意一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微 弹攻击的载体，如pCAMBIA系列载体、pBI系列载体、pBin系列载体或Gateway?系列载体。
[0011] 本发明的第三个目的是提供组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705在增强植物抗旱中 的应用。
[0012] 所述的应用优选为在培育抗旱植物品种中的应用。
[0013] 优选，所述的应用是将所述的组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705导入植物细胞、组 织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的组蛋白脱乙酰化酶基 因0sHDA705在植物中表达，得到抗旱的转基因植物。进一步优选，所述组蛋白脱乙酰化酶 基因0sHDA705是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。
[0014] 所述的植物优选为水稻。
[0015] 本发明克隆得到了属于水稻组蛋白脱乙酰化酶家族RPD3/HDA1亚家族的 0sHDA705基因，其作为正调控因子参与了水稻对干旱胁迫的应答过程，通过转基因及功能 鉴定证实超量表达0sHDA705基因能提高水稻对干旱的抗性，0sHDA705基因在培育抗旱植 物尤其是水稻新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。
【附图说明】
[0016] 图1为超表达载体构建过程中，测序所得的cDNA序列与组蛋白脱乙酰化酶基因 0sHDA705序列的比对结果。
[0017] 图2是20% PEG处理水稻中花11植株0h、lh、3h和6h后0sHDA705基因的表达模 式。
[0018] 图3是用0sHDA705基因引物对0sHDA705基因超表达转基因植株基因组DNA PCR 的电泳图。
[0019] 图4是野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因株系0X3、0X7、0X18、0X21、 0X33、0X35 和 0X44 中 0sHDA705 基因的表达水平检测，HDA7050X3、HDA7050X7、HDA7050X18、 HDA7050X21、HDA7050X33、HDA7050X35 和 HDA7050X44 分别代表 0sHDA705 基因超表达转基 因株系 0X3、0X7、0X18、0X21、0X33、0X35 和 0X44。
[0020] 图5是苗龄两周野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因植株0X3-8-4、 0X7-6-1和0X33-2在标准营养液培养下的表型。
[0021] 图6是苗龄两周野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因植株0X3-8-4、 0X7-6-1和0X33-2在含15% PEG标准营养液中生长4天的表型。
[0022] 图7是苗龄两周野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因植株0X3-8-4、 0X7-6-1和0X33-2在含15% PEG标准营养液生长4天后在标准营养液中恢复生长7天的 表型。
[0023] 图8是苗龄两周野生型植株CK和0sHDA705基因超表达转基因植株0X3-8-4、 0X7-6-1和0X33-2在含15% PEG标准营养液生长4天后在标准营养液中恢复生长7天的 存活率统计。
[0024] 图9是pCUbiO 1301植物双元表达载体图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0026] 下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等 《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产 品生产厂商的使用说明。
[0027] 实施例中所用水稻中花ll(0ryza Sativa L.)种子购于广东省农科院；TriZol Reagent购自Invitrogen公司，其货号为：15596026;逆转录酶M-MLV购自Promega公司， 其货号为：M1701 ;pGEMT载体购自Promega公司，其货号为：A1360 ;标准营养液为国际水稻 所标准营养液；LB、YM、AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分 子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得 到。
[0028] 实施例1 :0sHDA705基因的克隆
[0029] 取水稻中花11的幼苗叶片部位，用TriZol Reagent提取叶片总RNA，采用琼脂糖 凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取2 μ g的总RNA做起始逆转录反应， 所采用的逆转录酶为M-MLV，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录产物 为模板，采用引物：F :ATGGCGGCGTCCGGCGAGGG，R :CTAGGAATCATCATTCGATT 进行常规 PCR 扩 增，PCR 反应条件为：94°C，4min ;94°C，30sec ;55°C，45sec ;72°C，90sec ;30 个循环；72°C， lOmin。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接于pGEMT载体上，连接反应：PCR产物7 μ 1， pGEM T 载体 lyl，3U T41igase lyl，10Xbuffer ΙμL，共 ΙΟμΙ 体积，16°C连接 3h。取 5以1连接产物，转到大肠杆菌0册€1中，加8()()以11^，复苏111，涂于含1()()11^/1氨苄抗生素 (Amp)的LB平板上（已经涂布X-gal/IPTG)，37°C过夜。挑取白色克隆，在LB+Amp(100mg/L) 液体培养基中扩增培养，送交测序。逆转录获得的产物cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，开放阅读框从第73位到1449位碱基，长1377bp，如图1所示；将此开放阅读框命名 为组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705,其编码458个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 示，将该蛋白命名为组蛋白脱乙酰化酶0sHDA705。
[0030] 实施例2 :组蛋白脱乙酰化酶基因0SHDA705在逆境胁迫下的表达模式分析
[0031] 1.胁迫处理：将水稻中花11种子浸泡催芽后，在发芽盒内用标准营养液水培 生长，在25°C，16h光照/8h黑暗光周期条件下的光照培养室中培养两周，光照强度为 100001ux。模拟干旱处理 ：20%PEG处理0h、lh、3h和6h。将处理的植株用液氮速冻后 于-80°C低温保存。
[0032] 2. RNA提取：用Trizol reagent进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格 按照Trizol reagent的RNA提取流程说明进行。
[0033] 3.逆转录：采用M-MLV逆转录酶逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明 书进行。
[0034] 4.实时定量RT-PCR :根据组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705的核苷酸序列，设计以 下引物对：qHDA705-F :CATGACAGACCATCAGATCCTG ;qHDA705-R :CCACTCCATAACCTACTGCG。将 所得cDNA稀释5倍后作为模板，进行实时定量RT-PCR反应。反应体系及程序参照SYBRO)) Premix Ex Taq? II(TaKaRa)说明书，在 ABI 7500Real_time PCR 仪上进行反应。每个反 应设置3个重复，所得数据使用ABI 7500Real-time PCR system软件进行处理。
[0035] 5.结果分析：水稻中花11植株中的组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705的表达量， 在20% PEG处理后呈明显上升然后恢复的趋势，结果如图2所示。结果表明水稻中组蛋白 脱乙酰化酶基因0sHDA705受干旱的诱导后表达量明显上升，参与水稻的抗旱胁迫应答调 节过程。
[0036] 实施例3 :转组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705水稻的获得和鉴定
[0037] 1.目的基因组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705的超表达载体的构建
[0038] 根据组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705全长设计引物，以水稻中花11的cDNA为 模板，高保真扩增获得组蛋白脱乙酰化酶基因0sHDA705全长，同时在两条引物的5'端加 上Bgl II 酶切位点，扩增引物为 HDA7050X-F ：GAAGATCTATGGCGGCGTCCGGCGAGGG (下划线部分 为 Bgl II 酶切位点）:HDA7050X-R :GAAGAT