一种能感染中国仓鼠卵巢细胞病毒适应株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种能感染中国仓鼠卵巢细胞病 毒适应株及其在疫苗开发方面的应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒EV71型属于小RNA病毒科肠道病毒属，感染者主要为学龄前儿童，主要 引起手足口病，同时还可以引起无菌性脑膜炎，脑炎，脊髓灰质炎样麻痹等神经系统相关的 并发症。1974年首次报道以来，已在世界范围内引起多次爆发与流行。1997年开始在亚太 地区大规模流行并呈上升趋势，已经成为一种严重的公共健康问题。1998年我国台湾地区 EV71大爆发，129106例发生手足口病和红斑疹，405例为严重的中枢神经系统感染，死亡78 例。
[0003] 2008年，我国安徽阜阳手足口病疫情爆发，其中23例死亡，随后，北京、上海、浙 江、广东等地区也相继有EV71感染的报道。2009年继河南省明泉县报道手足口病感染并有 十例病人死亡后，相继在山东、北京、四川、广西、云南、甘肃、贵州等多个省市流行，患病人 数和死亡人数超过2008年近两倍。2010年我国内地共有1，774, 669个报告病例，造成905 例死亡和超过2. 1万例重症。死亡原因主要为由中枢神经系统感染而导致的脑干脑炎，肺 水肿和出血。
[0004] EV71感染后的治疗药物包括干扰素（IFN-α)、静脉注射丙种球蛋白（IV I G)和 一种新药Pleconaril。尽管有EV71灭活疫苗主动免疫制止感染的流行以及基因工程亚单 位疫苗成功地用于实验动物的报道，但目前尚没有被公认是十分有效的疫苗。因此，研制出 有效的抗EV71病毒的疫苗迫在眉睫，对保障儿童的生命安全和健康成长有重要意义。
[0005] 目前开展的EV71疫苗研究种类包括灭活全病毒疫苗，减毒活疫苗，病毒样颗粒疫 苗（杆状病毒表达的VLP疫苗），DNA疫苗和大肠杆菌表达的VPl亚单位疫苗等。其中减毒 活疫苗不破坏病毒的构象表位，并可诱导产生具有保护作用的中和抗体，且具有一定的交 叉保护能力。但减毒EV71还具有一定的毒力，有毒力恢复的危险，存在一定的安全隐患。
[0006] 杆状病毒表达系统表达的VLP可以诱导小鼠产生细胞和体液免疫，对小鼠具有一 定的保护能力，但是还缺乏VLP交叉保护的研究。其他VPl亚单位疫苗及DNA疫苗诱导机 体产生的中和抗体滴度较低，尚难以作为疫苗开发，需进行进一步研究。
[0007] EV71全病毒灭活疫苗有较好的免疫原性，生产工艺成熟，是研发进展最快的疫苗。 2013年3月中国自主研发的EV71灭活疫苗III期临床试验顺利完成，为EV71疫苗上市从 而有效预防EV71型手足口病提供了科学依据。
[0008] 利用遗传进化上跟人类比较远的苍鼠 CHO-K细胞生产EV71全病毒灭活疫苗理论 上比MDCK细胞和CHO-K细胞更加安全。但是，目前本领域还没有在CHO-K细胞上进行研制 的EV71病毒疫苗。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于提供一种能感染中国仓鼠卵巢细胞病毒适应株及其应用。
[0010] 在本发明的第一方面，提供一种肠道病毒71突变株，其基因组编码结构蛋白VP1、 VP2、VP3、VP4及非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D ;其中，VPl的第36位氨基酸为Asn，第 258位氨基酸为Val ;2A的第77位氨基酸为Thr ;2C的第171位氨基酸为Met，第305位氨 基酸为Ala。
[0011] 在一个优选例中，所述的VP4的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述的VP2的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述的VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；所述的VPl 的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示；所述的2A的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示；所述的 2B的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示；所述的2C的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述 的3A的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述的3B的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示； 所述的3C的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；或所述的3D的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12 所示。
[0012] 在另一优选例中，所述的肠道病毒71突变株，其基因组编码的蛋白的氨基酸序列 如 SEQ ID NO: 13 所示。
[0013] 在另一优选例中，所述的肠道病毒71突变株的基因组具有SEQ ID NO: 1所示的核 苷酸序列。
[0014] 在本发明的另一方面，提供所述的肠道病毒71突变株的用途，用于基于CHO细胞 建立肠道病毒71病毒反向遗传学技术；或用于克隆、进一步改造肠道病毒71病毒以增强病 毒扩增能力或者降低其对人的细胞的感染性，或者改变肠道病毒71病毒对宿主亲嗜性。
[0015] 在本发明的另一方面，提供所述的肠道病毒71突变株的用途，用于制备减毒EV71 活疫苗或灭活疫苗；或
[0016] 用于预防肠道病毒71以及其它引起手足口病的肠道病毒的感染。
[0017] 在本发明的另一方面，提供所述的肠道病毒71突变株的用途，用于制备肠道病毒 71感染的细胞模型，或用于评价疫苗的保护效果或安全性，或用于减毒EV71活疫苗或灭活 疫苗的研究；较佳地，所述的细胞是CHO细胞。
[0018] 在一个优选例中，所述的肠道病毒71感染的细胞模型用于抗肠道病毒71感染药 物的筛选、药效研究。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，其中包含容器，以及装于容器中的所述的 肠道病毒71突变株。
[0020] 在一个优选例中，所述的试剂盒用于制备肠道病毒71感染的细胞模型，或用于评 价疫苗的保护效果或安全性，或用于减毒EV71活疫苗或灭活疫苗的研究。
[0021] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0022] 图UMAVS573盲传 CHO-K细胞系筛选获得的使CHO-K出现明显病变的CHO-K适应 株（CAVS)。
[0023] 图2、病毒滴度（TCID50)测定。
[0024] 图3、CAVS-5#对于CHO-K细胞的感染图，其中MOCK为正常CHO-K细胞。
[0025] 图4、CAVS-5#，MAVS，FY573病毒分别在不同细胞系CHO-K，RD，SK-N-SH上的生长 曲线。
[0026] 图5、将MAVS573分别感染CHO-K和RD，然后做生长曲线，分析感染情况。
[0027] 图6、将病毒CAVS-5#，FY573，MAVS感染RD，CH〇-K，SK-N-SH细胞系，观察细胞上的 病变情况。
【具体实施方式】
[0028] 本发明经过广泛的研究，获得了一株EV71的CHO-K适应株（CAVS-5#)，能有效感染 CHO-K细胞，其在RD细胞上的感染力低于CHO细胞适应株MAVS573和人EV71毒株FY573， 有一定的减毒作用，对该适应株进行测序及序列比对，发现了 5个氨基酸突变位点。本发明 的突变病毒株可被应用于制备减毒EV71活疫苗或灭活疫苗等。
[0029] 病毒蛋白及编码基因
[0030] 本发明所述的EV71病毒突变株包括结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,非结构蛋白包 括2A、2B、2C及3A、3B、3C和3D ;编码这些蛋白的基因在病毒基因组中如下排列：VP4-VP2-V P3-VPI-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D。
[0031] 进一步的研究发现，EV71病毒突变株中，VP1、2A、2C中的一些氨基酸突变贡献了 该EV71病毒株的CHO细胞适应性，使之对于CHO细胞的感染能力显著增强。所述位点如 下：VPl的第36位氨基酸为Asn，第258位氨基酸为Val ;2A的第77位氨基酸为Thr ;2C的 第171位氨基酸为Met，第305位氨基酸为Ala。
[0032] 本发明还包括上述各突变型病毒蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语 "片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的突变型病毒蛋白相同的生物学功能 或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保 守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可 以是也可以不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的 多肽，或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序 列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。根据本文的定义这些片段、衍生 物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。但是，所述的片段、衍生物和类似物中， 对应于前段所述贡献CHO细胞适应性的位点的氨基酸是保守的。
[0033] 本发明还提供了编码本发明突变型病毒蛋白的多核苷酸序列。本发明还涉及上述 多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和 衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些 核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是 一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质 上改变其编码的多肽的功能。
[0034] 本发明的编码突变型多肽的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工 合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅 读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0035] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，通常，通过先合成多个小片段，然 后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0036] 病毒突变株
[0037] 本发明通过EV71病毒株的分离，培养，细胞筛选等技术手段得到了能有效感染 CHO-K产生适应性突变的病毒株，为EV71引起的手足口病的疫苗研发提供有力的支持。
[0038] 首先，本发明运用ICR小鼠适应性毒株573通过病毒感染实验，获得了能够高效感 染CHO-K的适应性毒株。
[0039] 其次，通过空斑克隆筛选进一步纯化该CHO-K适应性毒株5# (CHO-K adapted virus strain5#, CAVS-5#)〇
[0040] 第三，为了进一步确认CAVS-5#基因特征，发明人对其基因和氨基酸序列进行了 比对，确定了氨基酸突变位点，为工程化疫苗提供改造方案。
[0041] 因此，本发明提供了一种EV71病毒突变株，相对于野生型出发菌株其感染CHO细 胞的能力大大增强。所