齐墩果酸提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及齐墩果酸的新用途，特别涉及齐墩果酸提高人脐 带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途。
【背景技术】
[0002] 自从人类进入工业化社会以来，由于受到环境污染、人们生活节奏加快等因素的 影响，世界范围内不孕不育夫妇的总发病率明显升高。在不孕不育的相关因素中，生殖细 胞（精子或卵母细胞）数量和质量缺陷所占比例正逐年上升。另外，一些肿瘤患者由于放 疗和化疗而失去了生殖能力，不能产生健康的生殖细胞。近年来辅助生殖技术（ART)的发 展和应用，使许多不孕不育患者受益匪浅，但是对于卵巢功能早衰的女性及不能产生精子 或精子畸形的男性，要想生育具有自身遗传信息的后代只依靠 ART和药物治疗是远远不够 的，因此寻找一种新的细胞治疗手段非常迫切。
[0003] 干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，所以成为细 胞治疗中理想的种子细胞来源。胚胎干细胞具有全能性，能分化为各个胚层来源的细胞，但 由于存在移植后免疫排斥、致瘤性和伦理问题等，限制了其在干细胞领域的应用。成体干细 胞避免了上述胚胎干细胞的缺点，且具有多向分化的潜能，在一定条件下也能分化为各个 胚层来源的细胞。间充质干细胞作为成体干细胞家族的重要成员，在体内或体外特定的诱 导条件下，可分化为脂肪、软骨、肌肉、神经、肝、心肌、胰岛、内皮等多种组织细胞，正日益受 到人们的关注。
[0004] 人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells， hUC-MSCs)是存在于新生儿脐带中的间充质干细胞，在个体出生时获得，被认为是个体的健 康保险，其优势在于：能稳定扩增80代不发生变化，比骨髓间充质干细胞具有更强的增殖 能力和分化潜能；来源丰富、取材方便，获取时不会对捐献者造成新的痛苦和创伤；具有较 低的免疫原性。近年来在体外条件下用干细胞诱导向生殖细胞方向分化的报道屡见不鲜， 但是用hUC-MSCs诱导向生殖细胞方向分化的报道较少。2009年黄鹏【黄鹏，人脐带华尔通 氏胶源间充质干细胞向男性生殖细胞诱导分化的研宄，汕头大学，2010年】证实，hUC-MSCs 在维甲酸（retinoic acid，RA)、睾酮及睾丸细胞培养液中能向精原细胞诱导分化；2010 年 Li Cai-xia 等[Li Cai-xia etal， In vitro female germline potential of human umbilical cord-derived matrix stem cells， Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research，2010,14 (40) :7583-7587】用卵泡液诱导 hUC-MSCs 分化为 卵样结构的细胞。但是已有的报道中诱导hUC-MSCs向生殖细胞方向分化的方法诱导时间 久、诱导过程复杂、诱导效率不高，至今尚缺乏简单易行、诱导效果好的定向诱导hUC-MSCs 向生殖细胞方向分化的方法。
[0005] 齐墩果酸（Oleanolic acid，0A)是五环三萜类化合物，以游离或结合成苷的形式 存在于白花蛇舌草、山楂、丁香、大枣、女贞子、枇杷叶、橡木及夏枯草等植物中，齐墩果酸具 有保肝、降糖、降血脂和抗肿瘤等生物活性。目前关于齐墩果酸诱导干细胞分化的研宄仅是 针对小鼠胚胎干细胞分化或大鼠骨髓间充质干细胞分化，未见齐墩果酸体外诱导人脐带间 充质干细胞分化的报道，更未见齐墩果酸体外提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基 因的表达水平的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物 提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途及方法；所述生殖细胞标 志基因是Stra8、Itgbl和/或Itga6。
[0007] 本发明提供了齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为提高 人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的诱导分化剂的用途；所述生殖细胞 标志基因是Stra8、Itgbl和/或Itga6。
[0008] 诱导分化剂，即诱导细胞分化的物质，这种物质可以是单一化合物，也可以是多种 成分的组合，其存在或使用的形式可以是固体、半固体，也可以是液体。
[0009] 本发明还提供了一种提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因 Stra8、Itgbl 和/或Itga6的表达水平的方法，它是利用齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或 糖苷衍生物进行诱导的，包括如下步骤：
[0010] (1)取人脐带间充质干细胞，置于间充质干细胞培养液中培养；
[0011] (2)加入齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物，诱导培养72 小时，即可。
[0012] 其中，步骤（1)中，所述人脐带间充质干细胞培养液是含10%胎牛血清的DMEM高 糖培养液。
[0013] 其中，步骤（2)中，在细胞汇合度为60~70%时，加入齐墩果酸或其药学上可接受 的盐、酯、水合物、糖苷衍生物。
[0014] 进一步地，步骤（2)中，加入的齐墩果酸的终浓度为3. 0 μ g/ml。
[0015] "齐墩果酸的终浓度"，是指齐墩果酸加入到人脐带间充质干细胞培养液后，在培 养液中所占的浓度。
[0016] 本发明还提供了上述方法制备得到的细胞。
[0017] 其中，所述细胞中，Stra8、Itgbl、Itga6相对于内参基因 GAPDH的表达量分别是 2·34Ε-04、3· 7400、0· 0807。
[0018] 根据公知常识，干细胞分化为生殖细胞需要经过标志基因表达模式改变、细胞形 态变化、减速分裂、最终成形等阶段。标志基因表达模式改变的具体表现就是生殖细胞标志 基因的高表达，这个阶段是整个分化过程最为重要的阶段之一，非常重要，此阶段相当于给 干细胞的分化定下了轨迹，在后期只要给予合适的条件，就能最终分化得到生殖细胞。
[0019] 本发明的齐墩果酸可以显著提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表 达水平：Stra8、Itgbl、Itga6,且效果优于现有的阳性药物一一维甲酸，可以促进人脐带间 充质干细胞的标志基因表达模式向着生殖细胞的方向转变，促使人脐带间充质干细胞向生 殖细胞方向定向分化；本发明方法制备得到的细胞具有分化为生殖细胞的潜力，有可能制 备成为体外受精技术的原材料，为不孕不育疾病的治疗提供了新的思路，具有重要的临床 应用价值。
[0020] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
[0021] 下面以实施例对本
【发明内容】
作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。凡基 于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0022] 图1干预前人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代表200 μ m。
[0023] 图2齐墩果酸（OA)干预72小时后人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代 表 200 μ m〇
[0024] 图3维甲酸（RA)干预72小时后人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代表 200 μ m〇
[0025] 图4阴性对照DMSO干预72小时后人脐带间充质干细胞的细胞形态，图中标尺代 表 200 μ m〇
【具体实施方式】
[0026] 本发明所用的仪器、耗材及试剂如表1所示：
[0027] 表1本发明所用的仪器、耗材、试剂
[0028]
【主权项】
1. 齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物提高人脐带间充质干细 胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途；所述生殖细胞标志基因是Stra8、Itgbl和/或 Itga6〇
2. 齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为提高人脐带间充质 干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的诱导分化剂的用途；所述生殖细胞标志基因是 Stra8、Itgbl 和 / 或 Itga6。
3. -种提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因Stra8、Itgbl和/或Itga6的 表达水平的方法，其特征在于：它是利用齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物或糖 苷衍生物进行诱导的，包括如下步骤： (1) 取人脐带间充质干细胞，置于间充质干细胞培养液中培养； (2) 加入齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物，诱导培养72小时， 即可。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1)中，所述人脐带间充质干细胞培 养液是含10 %胎牛血清的DMEM高糖培养液。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤⑵中，在细胞汇合度为60~70% 时，加入齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2)中，加入的齐墩果酸的终浓度为 3. 0 y g/ml 〇
7. 权利要求3~6任意一项所述的方法制备得到的细胞。
8. 根据权利要求7所述的细胞，其特征在于：所述细胞中，Stra8、Itgblltga6相对于 内参基因 GAPDH 的表达量分别是 2. 34E-04±0. 97E-04、3. 7400±0. 1085、0. 0807±0. 0204。
【专利摘要】本发明提供了齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的用途；所述生殖细胞标志基因是Stra8、Itgb1和/或Itga6。本发明还提供了齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平的诱导分化剂的用途；所述生殖细胞标志基因是Stra8、Itgb1和/或Itga6。本发明研究表明，齐墩果酸可以体外提高人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平，可以将齐墩果酸或其药学上可接受的盐、酯、水合物、糖苷衍生物作为诱导人脐带间充质干细胞中生殖细胞标志基因的表达水平提高的诱导分化剂使用，为不孕不育疾病的治疗提供了新的思路，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】C12N5-0775
【公开号】CN104805056
【申请号】CN201510252802
【发明人】万谦, 陈强, 蒋小辉, 陆华
【申请人】四川新生命干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月18日