产头孢菌素g的重组菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及产头孢菌素 G的重组菌及其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 7 -氨基去乙醜氧基头抱烧酸（7-Amin〇-3_Desacetoxy Cephalosporanic Acid，7-ADCA)是头孢菌素的母核，是制备头孢氨苄、头孢拉定和头孢羟氨苄等头孢类抗 生素的重要中间体之一。7-ADCA的工业合成方法主要包括两个步骤：（1)青霉素 G化 学扩环生成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸，又称苯乙酰-7-ADCA或头孢菌素 G (phenylacetyl-7-ADCA，G-7-ADCA，DAOG) ;(2)G-7-ADCA 经青霉素 G 酰化酶催化脱去侧链 得到7-ADCA。对脱去侧链的步骤已经有充分的研究，而扩环反应成为合成工艺中的重要研 究方向。通过化学法进行扩环反应存在复杂、成本高，且副产品和有机溶剂对环境不利等缺 点，因此，急需使用一种对环境友好的方法来代替化学扩环法。扩环酶（Expandase)又叫脱 乙醜氧基头抱菌素 C合成酶（Deacetoxycephalosporin C Synthetase, DA0CS)催化青霉素 的五员噻唑环氧化扩环形成头孢菌素的六员噻嗪环，是头孢菌素生物合成的关键酶。来 自顶头孢（C. acremonium)、棒状链霉菌（Streptomyces clavuligerus)、耐内酰胺诺卡氏菌 (Nocardia Lactamdurans)的DAOCS已经被克隆表达和表征。但DAOCS的天然底物是青霉 素 N，难以大量获得，此外即使青霉素 N扩环成功，其侧链也很难用酰化酶切除。因此，人们 以廉价的青霉素 G为原料开展了向头孢菌素转化的研究。通过对DAOCS进行了随机和定向 突变，希望其能够转化低廉且易获得的原料青霉素 G，实现头孢菌素 C的大规模生产，虽然 酶的改造取得了很大的进展，但酶法制备头孢菌素发展缓慢。主要是由于在DAOCS在体外 不稳定，转化效率低，且反应需要α -酮戊二酸作为辅因子，导致酶法制备头孢菌素的成本 较闻。
[0003] 全细胞生物转化是一种高效、绿色的生物转化过程，已成功运用在多种产品的工 业化生产上。全细胞催化通过细胞壁的保护使酶更加稳定，并且可以利用细胞内的辅因 子，从而降低催化剂的成本，提高生物催化的效率。Arnold L. Demian研究组用棒状链霉 菌或变铅青链霉菌（Streptomyces Iividans)进行生产G-7-ADCA，但产量最高为0· 2g/L。 (Demain AL1Baez-Vasquez MA. 2000.1 mmobilized Streptomyces clavuligerus NPlcells for biotransformation of penicillin G into deacetoxycephalosporin G. Applied biochemistry and biotechnology87:135-40 ；Gao Q, Piret J, Adrio J, Demain A. 2003. Performance of a recombinant strain of Streptomyces lividans for bioconversion of penicillin G to deacetoxycephalosporin G. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology30:190-4)。随着我国青霉素的发酵技术水平的提高，生产成本不断降 低，青霉素的生产能力不断增大，除了出口和国内临床使用外，尚有较多余量，因此以廉价 青霉素为原料开发头孢菌素类抗生素是值得重视的途径。特别是全细胞催化法青霉素 G产 G-7-ADCA值得深入研究。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的一个技术问题是提供头孢菌素 G (G-7-ADCA)产量高的产头孢 菌素 G (G-7-ADCA)的重组菌及其构建方法。
[0005] 本发明所提供的产头孢菌素 G的重组菌的构建方法，包括将扩环酶基因导入受体 菌得到产头孢菌素 G的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。
[0006] 上述方法中，所述突变型大肠杆菌为下述Al至A8中的任一种：
[0007] A1、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行下述al_a4的改造得到的 所述野生型大肠杆菌的突变体（PG22);
[0008] al、将α -酮戊二酸脱氢酶基因敲除，该改造以"Λ sucA"表示；
[0009] a2、将异柠檬酸裂合酶基因敲除，该改造以"Λ aceA"表示；
[0010] a3、将β -内酰胺酶基因敲除，该改造以"AampC"表示；
[0011] a4、用乙酰辅酶A合成酶基因（acs)替换丙酮酸氧化酶基因（poxB)，该改造以 "Λ poxB: :acs，'表不；
[0012] A2、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述al、所述a3和所述a4 改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG15);
[0013] A3、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述al和所述a3改造得 到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG14);
[0014] A4、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述al、所述a2和所述a3 改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG20);
[0015] A5、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述al和所述a4改造得 到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG03);
[0016] A6、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述al、所述a2和所述a4 改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG05);
[0017] A7、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述al改造得到的所述 野生型大肠杆菌的突变体（PGOl);
[0018] A8、所述突变型大肠杆菌为对所述野生型大肠杆菌进行所述al和所述a2改造得 到的所述野生型大肠杆菌的突变体（PG16)。
[0019] 上述敲除和替换均可通过同源重组实现。
[0020] 上述方法中，所述扩环酶基因可编码bl和b2的蛋白质：
[0021] bl、由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0022] b2、在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有脱乙酰氧基头孢菌素 C合成酶活性的由bl)衍生的蛋白质。
[0023] 上述方法中，所述α -酮戊二酸脱氢酶基因（sucA)可编码cl和c2的蛋白质：
[0024] cl、由SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0025] c2、在SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有α -酮戊二酸脱氢酶活性的由cl)衍生的蛋白质；
[0026] 所述乙酰辅酶A合成酶基因（acs)可编码dl和d2的蛋白质：
[0027] dl、由SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0028] d2、在SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有乙酰辅酶A合成酶活性的由dl)衍生的蛋白质；
[0029] 所述丙酮酸氧化酶基因（poxB)可编码el和e2的蛋白质：
[0030] el、由SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0031] e2、在SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有丙酮酸氧化酶活性的由el)衍生的蛋白质；
[0032] 所述异柠檬酸裂合酶基因（aceA)可编码Π 和f2的蛋白质：
[0033] Π 、由SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0034] f2、在SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或 几个氨基酸残基得到的具有异柠檬酸裂合酶活性的由Π )衍生的蛋白质；
[0035] 所述β -内酰胺酶基因（ampC)可编码gl和g2的蛋白质：