一株降解邻苯二甲酸二异辛酯的无色杆菌(Achromobacter sp. )MT-H的制作方法
【专利说明】—株降解邻苯二甲酸二异辛酯的无色杆菌(Achromobacter
sp.)MT-H
技术领域
[0001]本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，具体地，涉及一株新型邻苯二甲酸二辛醋降解菌，更具体地，涉及一株降解邻苯二甲酸二异辛醋的无色杆菌iAchromobactersp.)MT-H0
【背景技术】
[0002]邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAEs，是邻苯二甲酸形成的酯的统称。其中，邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)是一种典型的邻苯二甲酸酯类物质，在人们日常生活中用途非常广泛，特别是作为塑料添加剂，在重量上可达20?50%。由于塑料制品中DEHP极易转移进入环境，从而广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。DEHP在邻苯二甲酸酯类物质中毒性最强，可以通过各种途径进入生物体内，严重干扰其内分泌、生殖及神经系统，并具有极强的致畸性、致突变性、致癌性。目前，DEHP已成为全球最普遍的污染物之一，并被美国国家环保局和中国环境监测总站列为优先控制污染物。
[0003]自然环境中DEHP的水解、光解和挥发速率非常缓慢，生物降解成为其从环境中消失的主要途径。但由于DEHP的侧链较长，尽管土壤中存在许多能降解DEHP的菌种，其自然降解能力也极弱，远远不能满足DEHP环境污染治理的需要。因此，对DEHP的处理有待于寻求高效降解菌。
[0004]目前对于微生物降解DEHP，国内外已经开展了大量研宄。例如，Kim等筛选分离出的一株尖孢镰刀菌，及Chao和Cheng等分离出的一株红球菌均对DEHP均具有良好的降解效果。但已报道的菌株对DEHP的降解速率还不能满足实际污染控制的要求，且有关能降解DEHP的无色杆菌种质资源鲜有报道。
【发明内容】
[0005]本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一株新型邻苯二甲酸二异辛酯降解菌。
[0006]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的:
一株无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO: M 2015058，保藏地址为:中国武汉武汉大学，菌株分类命名为Achromobactersp.MT-H。
[0007]本发明所述无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H来源于广州市大坦沙城市污水处理厂的回流污泥，经人工富集培养、分离纯化得到。该菌株对DEHP具有很高的降解效率，且在较宽的pH和温度范围内均能较好地降解DEHP，证明MT-H菌株可以作为优良的DEHP降解菌应用于DEHP污染的生物处理方面。
[0008]无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H在LB培养基上培养七天的菌落为圆形，微凸起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑。扫描电镜下多为球状或椭球状，直径为0.5—1 μ m0
[0009]无色杆菌{Achromobactersp.)菌株 MT-H 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:1所示，通过NCBI官方网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与相似性最高，同源率达99%。
[0010]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一株高效降解DEHP的新菌株一无色杆菌{Achromobacter sp.)菌株MT-H，丰富了邻苯二甲酸酯降解菌的种质资源库，而且该菌在较宽的pH和温度范围内均能较好地降解DEHP，证明MT-H菌株可以作为优良的DEHP降解菌应用于DEHP污染的生物处理方面。
【附图说明】
[0011]图1为MT-H菌在LB培养基上培养7天的生长形态特征。
[0012]图2为MT-H菌的扫描电镜照片。
[0013]图3为MT-H菌的16S rDNA的系统发育树。
[0014]图4为MT-H菌对不同浓度的DEHP的降解效果。
[0015]图5为MT-H菌在不同条件下(pH、温度和转速)对DEHP的降解效果。
【具体实施方式】
[0016]下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明的保护范围，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
[0017]实施例中所述培养基配方如下:
无机盐培养液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:
0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，FeCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最终 pH 为 7.5。
[0018]牛肉膏蛋白胨培养基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，加超纯水至1L，调节pH= 7.0 ;121°C灭菌20min。固体平板则添加1.5% (w/v)琼脂粉。
[0019]实施例1菌株的分离与鉴定
采集广州市大坦沙城市污水处理厂的回流污泥，称取5 g活性污泥样品于含有50 mL无菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培养3天后取5 mL污泥悬液加入到100 mL含有DEHP (50 mg I/1)的上述MSM培养基中。经30°C，140 rpm培养7天后，每次按取ImL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高培养基中DEHP的含量至1000 mg L'然后将转接10次的培养液稀释103~105倍涂布于LB固体平板上，30°C倒置培养1~3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号MT-H。然后将菌株接种于LB固体平板上30°C倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板培养7天的菌落成圆形，微凸起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，光滑(见图1)。
[0020]扫描电镜样品制备与观察:将纯化后的菌株MT-H接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化。吸取800 μ L菌液经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入I mL的2.5%戊二醛充分混匀，4°C静置过夜。然后再次经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15 min，然后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脱水。经过CO2干燥后制片观察。扫描电镜下可以观察到该菌呈球状或椭球状，直径约为0.5~1μπι (见图2)0
菌株的16S rDNA分子鉴定:提取细菌总DNA，用细菌16S rDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序(由上海生工完成测序)后，序列如SEQ ID N0:1所示，将测序结果与GenBa