专利名称：一株氧化木糖无色杆菌mg1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株氧化木糖无色杆菌MGl及其应用，属微生物环境应用领域。
背景技术：
随着科技的发展，合成染料被广泛应用于纺织、皮革、食品、日用化工等行业中。但这些染料通常含有复杂的芳香环结构、化学稳定性高、环境可降解性低，且多数染料及其代谢中间产物具有致突变性、致癌性和其他毒性，这也使得染料成为重要的环境污染物之一。 作为污染源，染料的首先特点就是污染量大。据统计，目前世界染料年产量约为80 90万吨，我国染料年产量达15万吨，位居世界前列。在染料的使用过程中大约有10% 15%被直接排放到污水处理系统或环境中。其废水治理率不足30%，治理合格率仅57. 6%。因此， 仅从废水治理方面来看，染料行业的环境保护任务也是相当艰巨的。其中的三苯甲烷类染料是以三苯甲烷为母体的一类染料，其分子结构是中心碳原子上连有三个苯环，不同的侧链基团决定了不同染料结构和一些相应的特性。这类染料具有着色力强、色泽鲜艳等特点，因而被广泛用于纺织、造纸、医药、食品和化妆品等领域。较常见的有孔雀绿、结晶紫、及碱性品红。此外，它们还被广泛用做治疗皮肤病的药剂。但体外试验表明，这些化合物具有有丝分裂毒性。孔雀绿在浓度低至0. lmg/L时，对哺乳动物细胞都是高毒性的，能促进肝脏肿瘤的形成以及导致小白兔和鱼的异常增殖。因此，必须采取有效的措施来将染料的危害降到最低。对于染料处理，目前各国主要有物理、化学和生物的方法。但物化法的运行成本通常较高，效率较差，且容易产生二次污染。生物降解染料废水具有成本低，无二次污染，生态恢复性好等优点，已成为国内外学者研究的热点。生物降解处理是一种急待开发的新技术，因而筛选高效广谱的染料脱色菌株具有重要的理论和实用价值。氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)是一类广泛存在于环境中的杆状革兰氏阴性细菌。AchromcAacter xylosoxidans MGl是我们实验室从印染污水中分离筛选，并经过驯化得到的一株高效降解孔雀绿的菌株。关于其脱色活性和相关机理尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株氧化木糖无色杆菌MGl及其应用，通过对一株氧化木糖无色杆菌MGl的研究，开发生物脱色剂。本发明人在开展染料脱色机理的研究中，从印染污水分离到的细菌中筛选到氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)MGl菌株，MGl菌株已于2010年12月15日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0. 4476，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明筛选到的一株氧化木糖无色杆菌MG1，其特征为短杆状或圆棒状，多以散在形式存在，革兰氏阴性。在LB平板培上菌落小呈圆形，乳白色，凸起，不透明，表面湿润，
3边缘较整齐。同时我们的研究还发现，该菌株具有高效的降解三苯甲烷类染料孔雀绿和结晶紫的活性，其所具有的脱色功能主要源于胞内酶、及胞外小分子化合物成份。巢式PCR结果显示，该菌含有降解三苯甲烷类染料的基因tmr。甲吡酮抑制实验表明，细胞色素P450不参与胞内的染料降解过程。此外，菌体本身也具有对染料进行物理性吸附的作用。本发明通过常规的方法从自然界中进行菌株分离、纯化、培养，然后经过五次驯化处理，使其具有超强的脱色高效性。在孔雀绿的浓度高达2000mg/L时，1小时对其脱色率可高达86 士 1 %。本发明的菌株对三苯甲烷类染料中的结晶紫有较好的脱色的作用，能够作为制备生物脱色剂的应用。本发明具有能扩宽降解染料的菌种范围，使得环境中的孔雀绿、结晶紫多了一条人工降解的途径，降低环境污染治理成本的优点。
图1为氧化木糖无色杆菌MGl的菌落形态照片及其光镜下的菌体。其中图l-a为氧化木糖无色杆菌MGl的菌落形态；图Ι-b为光镜观察的氧化木糖无色杆菌MGl。图2显示氧化木糖无色杆菌MGl在不同孔雀绿浓度下的脱色率。图3为氧化木糖无色杆菌MGl中基因tmr的克隆和序列的比对结果。其中3_a为 PCR扩增基因tmr的琼脂糖电泳图；图3_b为基因tmr和CitrcAacter来源的同源序列比对的结果。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。本发明是这样实现的筛选纯化出氧化木糖无色杆菌后，用孔雀绿对其进行多次驯化。然后测其最终的脱色活性。并对其胞内和胞外的脱色机理进行探究。氧化木糖无色杆菌MGl的纯化、培养及驯化方法(以下为重量百分比)1、平板纯化培养LB 平板培养基配方为0. 5 % YeastExtract, 1 % Tryptone, 1 % NaCl，1. 5-2 % Agar，pH自然。将混合菌体接种到平板培养基上，37°C下培养，获得单菌落。2、液体扩大培养LB 液体培养基配方为0.5% Yeast Extract, 1% Tryptone, 1% NaCl，余下的为水，PH自然。将平板上的单菌落接种进液体培养基，过夜培养直到0D_为0. 50 0. 60。恒温摇床温度为38°C，转速为190rpm。3、菌株的驯化化培养基的配方为ΚΗ2Ρ040·05 %, K2HPO4O. 15 %, NaCl 0. 05 %, MgSO4 · 7Η200· 05%, NH4Cl 0. 1%，孔雀绿的浓度由50mg/L增至最后的100mg/L。每次驯化的时间为5天。驯化在38°C的恒温摇床上进行，转速为190rpm。氧化木糖无色杆菌MGl对孔雀绿的脱色试验1、不同菌株脱色能力的测试脱色培养基成分为0.5%YeastExtract，1 % iTryptone, 1 % NaCl，40mg/L 的孔雀绿。将经过过夜培养的菌液按一定的接种量接种进脱色培养基，定时测试不同菌株的脱色率，筛选出其中脱色能力最强的一株。2、脱色率的计算方法孔雀绿的特征性吸收波峰为617nm，脱色率就是通过紫外-可见光扫描式分光光度仪测试在最大吸收波峰处峰值的降低情况来进行计算的。将脱色后的培养液离心处理 (12，000印111，2分钟)，上清在61711111处测吸光度。脱色率的计算公式为脱色率(%) = 100 (A-B)/A其中A是未经细菌脱色的617nm吸光度B为细菌脱色后的617nm吸光度3、外界不同环境对脱色率的影响(1)测试温度、PH、溶氧对脱色率影响实验，方法如下菌种接种在含90ml LB液体培养基的250ml三角瓶中过夜培养，温度38 °C，转速190rpm，使最终菌体的0D_为0. 50 0. 60。为测试温度对脱色率的影响，无菌接入 10ml400mg/l的孔雀绿(终浓度为40mg/l)，将培养物分别放入、38°C及48°C恒温摇床上进行脱色培养，转速190rpm。测试PH值因素时，将接入孔雀绿(浓度同上)的培养物用 HCl 和 NaOH 将其最终 PH 分别调至 3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. 0,12. 0，然后置于190rpm、38°C的恒温摇床上。溶氧也是影响脱色的一个因素，我们通过选择不同转速的摇床(Orpm、lOOrpm、190rpm)对溶氧量的影响进行了测试，在Orpm的情况下，还分别用矿物油对脱色培养物采取液封和不液封两种情形检测其脱色率的差异。(2)不同碳源对菌体脱色影响的实验方法如下为了测试不同碳源下氧化木糖无色杆菌MGl对孔雀绿的降解情况，我们选择了常用的5种碳源进行了实验。基础培养基是M9，配方如下12. 8g/lNa2HP04 ·7Η20，3g/lKH2P04， 0. 5g/l NaCl，1. 0g/lNH4Cl，不同的碳源分别为 5. Og/1 Yeast extracts, 10g/l Peptone, 3g/l BeefExtract, 10g/l Glucose 禾口 3g/l Beefextract 与 5g/l Peptone for Fish 的混合碳源。最后添加孔雀绿，使其终浓度为40mg/l。细菌的培养方式同上，之后将发酵液在 8，OOOrpm下离心10分钟，弃去上清，沉淀的细胞在无菌条件下加入到上述的含不同碳源的 M9脱色培养基中，190rpm，38°C下进行脱色培养。4、脱色机理的探究实验(1)验证脱色过程是否有细胞色素P450的参与(甲吡酮抑制实验)将氧化木糖无色杆菌MGl过夜培养，发酵液8，500rpm、4°C离心15分钟。沉淀用含 ImM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液(PH为7)吹洗悬浮，然后在冰上通过超声将菌体破碎(超声 5秒，停7秒，破碎时间15分钟，48%振幅)，之后加入MgCl2使其终浓度为2mM。12，OOOrpm、 4°C离心1分钟去掉未破碎的细胞，12，000rpm、4°C离心30分钟将细胞膜碎片(沉淀)和可溶性物质(上清)分开后，沉淀用含ImM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液吹洗悬浮，然后分别加入甲吡酮使其终浓度为IOmM (对照组不添加甲吡酮)，37°C温浴10分钟后，加入一定量的孔雀绿测其脱色活性。(2)脱色基因的克隆巢式PCR设计巢式PCR 的两对引物，分别为 P1(F)5，AGTCAAATCATTGCCATCGTG 3' ；Pl (R)5' GGTTTCCTTCAGAGGGGTC 3' ；P2 (F)5' GCTCTTTATCTCAGGTCCGC 3'；
5P2 (R) 5'ACACCAGCGTTTACGAGGA 3，。PCR 50tl 的体系为模板 1 μ 1，正向引物(10 μ M) 1 μ 1， 反向引物(10 μ Μ)1 μ 1，10 X Taq Buffer 5 μ 1，dNTP Mixture(2. 5mM)4 μ 1，Taq(2. 5U/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 37 μ 1。扩增的条件为94°C 30秒，56V 30秒，72°C 1分钟，总共35个循环。扩增出的片段测序后在GenBank中进行比对。(3)胞外脱色活性实验将细菌在含100ml LB培养基的250ml的三角瓶中38°C、190rpm过夜培养，当OD6tltl 为0. 50时，8，OOOrpm离心10分钟，然后再10，OOOrpm离心20分钟以充分地去除菌体。上清中加入孔雀绿使其终浓度为40mg/l，在不同的时间段内取样测脱色活性。对照组为不接菌的LB和不经离心处理的发酵液。5、实验结果从现在已有的报道来看，能对孔雀绿脱色的最高浓度是500 μ mol/1 (约lS^iig/ 1)，Pseudomonas otitidis W/L3在12小时内能降解到95%，而氧化木糖无色杆菌MGl在孔雀绿的浓度高达2000mg/L时，1小时对其脱色率可高达86士 1%。具体数据如下表。脱色的最佳条件为190rpm，38°C，PH为6时。在所测试的碳源中，最佳营养为Beefextract 与P印tone for Fish的混合碳源。巢式PCR结果显示，该菌株含有三苯甲烷还原酶的基因 tmr。甲吡酮抑制实验证明，尽管具有如此高效的脱色率，脱色过程并没有细胞色素P450的参与。而胞外物质则具有很强的脱色活性。表氧化木糖无色杆菌MGl在不同孔雀绿浓度下的脱色率
权利要求
1.一株氧化木糖无色杆菌MGl菌株，从印染污水中分离到的细菌中筛选到，其特征在于氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)MGl菌株，已于2010年12月15日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO. 4476。
2.权利要求1所述的氧化木糖无色杆菌MGl菌株，其特征在于该菌株从自然界分离后，经纯化、培养、驯化后，对三苯甲烷类染料孔雀绿具有超强的脱色活性，且对结晶紫亦有较好的脱色的作用，能够作为制备生物脱色剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一株氧化木糖无色杆菌MG1及其应用，属微生物环境应用领域。本发明通过常规的方法从从印染污水中分离到的细菌中筛选到，氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)MG1菌株，已于2010年12月15日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.4476。本发明的氧化木糖无色杆菌菌株MG1，对三苯甲烷类染料中的孔雀绿具有超强的脱色高效性，在孔雀绿的浓度高达2000mg/L时，1小时对其脱色率可高达86±1％。此外，MG1菌株对结晶紫也有较好的脱色的作用，能够作为制备生物脱色剂的应用本发明具有能扩宽降解染料的菌种范围，使得环境中的孔雀绿、结晶紫多了一条人工降解的途径，降低环境污染治理成本的优点。
文档编号C12N1/20GK102181379SQ20111002043
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者乔敏, 周薇, 张克勤, 王纪爱, 黄晓玮 申请人:云南大学