专利名称：检测农药的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用胆碱酯酶检测农药的方法和装置。具体地，本发明涉及一种基于固定有胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的磁性纳米粒子的新型农药检测方法，其中所述磁性纳米粒子充当载体以收集溶液中的胆碱酯酶。本发明还涉及采用上述方法的用于农药检测的便携式探測器。
背景技术：
根据数据统计，全球毎年消耗约250万吨农药，其中大多数被施用于农作物。然而，超过95%的农药在雨水和阳光的照射下，最终进入水、土壌和空气中，造成了严重的环境污染。另ー方面，农作物上残存的农药也会引发严重的食物中毒事件。世界卫生组织 (WHO)估计全球每年会发生100万农药中毒案例，并有2万人死亡。因此，开发ー种便携式家用农药传感器是迫切且重要的。有机氯、有机磷和氨基甲酸酯在20世纪60年代是三种主要的农药。后续研究发现大多数有机氯是持久性的有机污染物，当它们释放到环境中时会造成潜在危险。例如， DDT在20世纪中期曾被广泛用于控制害虫，但研究发现它会在食物链中累积，并造成鸟类的不孕，引发生态灾难，目前已在大多数国家中被禁止使用。目前有机磷和氨基甲酸酯已大量取代了有机氯，这两种农药占据农药市场的70%。有机磷和氨基甲酸酯均通过抑制乙酰胆碱酯酶(ACM)的活性因而导致过量的乙酰胆碱(ACh，乙酰胆碱酯酶的底物)在突触间隙积累来起作用。过量的乙酰胆碱可引起遍及整个个体的神经肌肉麻痹(长时间的肌肉收缩)，导致因窒息而死亡。基于有机磷和氨基甲酸酯对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果，已经开发了ー些农药传感器。基本上，它们的检测方法可分为以下两种方式一种是通过添加称为埃尔曼试剂(Ellman’ s reagent)的5，5' - ニ硫代双-(2-硝基苯甲酸)(5， 5' -dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)经由分光光度计检测。DTNB 与硫代胆碱 (thiocholine, TCh)反应以得到TNB，所述硫代胆碱是乙酰硫代胆碱(ATCh，ACh被ATCh代替以得到ニ硫键)的水解产物，TNB即5-硫代-2-硝基苯甲酸，是ー种在412nm具有最大吸收的黄色产物，如
图1所示。另外的检测方法包括PH值测量法和电化学法等，如图20所
7J\ ο与需要专业人员并仅用于分析化学实验室传统方法(色谱方法和偶联的色谱-光谱方法GC-MS，HPLC-MS)相比，乙酰胆碱酯酶检测系统通过简化或去除样品制备规程、使现场测试更方便快捷以及显著降低毎次分析的成本而具有补充或者替代传统方法的潜力。 然而，可靠性差和乙酰胆碱酯酶检测系统的短暂寿命仍限制了它的广泛应用。可靠性可通过增加信噪比(S/N)来增强，而由乙酰胆碱酯酶和农药之间的不可逆或部分可逆的抑制反应所致的乙酰胆碱酯酶短暂寿命可通过用新鮮的乙酰胆碱酯酶替代来容易地克服。増加信噪比的传统方式是通过将乙酰胆碱酯酶固定于具有高效电子转移的电极表面来进行的。已采用了多种基质材料，如普鲁士蓝、钴酞菁(CoPc)、聚(酰胺-胺)(PAMAM)、聚苯胺、金納米粒子(AuNPs)、多壁碳纳米管(MWNTs)、A1203、SiO2, ZnO等等。甲基对氧磷的低检测限在基于固定于AuWs和丝纤蛋白修饰的Pt电极上的乙酰胆碱酯酶的电流分析生物传感器中已降至6 X IO-11M0在实际应用中，此电流分析传感器的局限性是其在农药检测中的短暂寿命。 虽然被抑制的乙酰胆碱酯酶可通过肟(如碘解磷定(prolidoxime iodide))部分地复活以保留乙酰胆碱酯酶的活性，但是电极上的乙酰胆碱酯酶固定层仍然需要频繁地替换，以保证测量的可靠性，而固定层的更换需要小心的操作，否则乙酰胆碱酯酶层会失去与电极的接触，从而影响到测量。为了避免乙酰胆碱酯酶活性复活(耗时)以及乙酰胆碱酯酶层的替换(费力)，在本发明中，发明了一种基于固定有乙酰胆碱酯酶的水溶性磁性纳米粒子的新型农药检测方法。在此体系中，乙酰胆碱酯酶仍是信号源，而磁性纳米粒子充当乙酰胆碱酯酶载体以通过使用磁场收集乙酰胆碱酯酶来増加信噪比。当磁性纳米粒子大小小于20nm吋，其表现出超顺磁性，这意指如果去除磁场，这些水溶性磁性纳米粒子可用水洗去。通过这种方式，抑制的乙酰胆碱酯酶在检测后可被容易地替换棹，由于每次都采用新的乙酰胆碱酯酶，不需要对其活性进行复活，也就避免了寿命短的缺点。
发明内容
本发明涉及使用固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子检测农药的方法和装置，具体地本发明涉及如下各项1. 一种检测农药的方法，包括如下步骤(a)提供待测样品；(b)制备磁性纳米粒子，使胆碱酯酶与所述磁性纳米粒子接触，从而得到固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子；(C)向步骤(a)的所述待测样品中加入步骤(b)中得到的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子，并温育；(d)用磁场富集磁性纳米粒子；和(e)去除磁场，将富集的磁性纳米粒子分散在酶活性检测体系中，检测所述胆碱酯酶的酶活性，并通过酶活性来确定待测样品中农药的存在或其含量。2.项1的方法，其中所述农药为化学合成农药。3.项1的方法，其中所述农药选自下组有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、有机氮类农药、拟除虫菊酷类农药、有机氯类农药和有机氟类农药。4.项3的方法，其中所述有机磷类农药选自下组磷酸酯、一硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酯、膦酸酷、磷酰胺、硫代磷酰胺、焦磷酸酷。5.项3的方法，其中所述有机磷类农药选自草甘膦、乐果和马拉氧磷。6.项3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自下组N-甲基氨基甲酸酯类和ニ 甲基氨基甲酸酷。7.项3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自西维因和异丙威。8.项1-7中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子是通过选自下组的方法制备的湿化学法、化学气相法和物理方法。9.项8的方法，其中所述湿化学法选自沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液及反相微乳液法、水热法和多元醇还原法；所述化学气相法选自化学气相沉积法、化学气相凝聚法和等离子蒸发法；所述物理方法选自蒸发冷凝法和磁控溅射方法。10.项1-9中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子是合金、铁氧体和金属间化合物的磁性纳米粒子。11.项1-10中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子是含铁、钴、镍及其合金的磁性纳米粒子，优选为!^e3O4的纳米粒子。12.项1-11中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子的表面含有极性基团，优选柠檬酸根或羟基。13.项1-12中任ー项的方法，其中所述胆碱酯酶选自下组乙酰胆碱酯酶、丙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。14.项13的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶从选自下组的来源获得微生物、植物和动物，优选电鰻或电鳐。15.项1-14中任ー项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准磁性纳米粒子的步骤，优选通过标准曲线进行。16.项1-15中任ー项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准胆碱酯酶浓度的步骤，优选通过标准曲线进行。17.项1-16中任ー项的方法，其中在步骤(b)之前还包括洗涤磁性纳米粒子的步骤，优选用去离子水洗涤1-5次，更优选洗涤4次。18.项1-17中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过选自下组的方法进行的吸附法、化学交联法、共价键合法、物理包理法、电化学聚合法和分子自组装。19.项1-18中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是在PH 6-8，优选pH 7的条件下进行的。20.项1-19中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上的过程中，加入胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例为20U/g-330U/g，优选125U/g-300U/g， 更优选^OU/g。21.项1-20中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的(A)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；(B)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；和(C)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。22.项1-21中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的(a)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水中；(b)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液；和(c)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。23.项21-22中任ー项的方法，其中磁性纳米粒子溶液的浓度为0. l_10g/L，优选 0. 5-5g/L，更优选l_3g/L，更优选约2g/L。24.项21-22中任ー项的方法，其中胆碱酯酶溶液的浓度为0. Ι-lOU/ml，优选0. 5-2U/ml，更优选 lU/ml。25.项21-22中任ー项的方法，其中牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为 0. l_5g/L，优选 0. 5-2g/L，更优选 0. 8-1. 2g/L，更优选 lg/L。26.项1-25中任ー项的方法，其中在步骤(c)中向所述待测样品中加入 0. 05-lml，优选0. 1-0. 5ml，更优选0. 25ml固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液。27.项1マ6中任ー项的方法，其中在步骤(C)中将待测样品与固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子在0-60°C，优选20-50°C，更优选40°C，温育2分钟-2小吋，优选20分钟-1 小吋，更优选40分钟。28.项1-27中任ー项的方法，其中在步骤(d)中通过覆有外层的磁体富集磁性纳米粒子。29.项28的方法，其中所述磁体的直径为约2_10mm，优选3_8mm，更优选4mm。30.项1- 中任ー项的方法，其中所述步骤(d)进行1-10分钟，优选1-5分钟，更优选100秒。31.项1-30中任ー项的方法，其中在步骤(d)中富集至少60%，优选至少80%，更优选至少90%，更优选基本上100%的磁性纳米粒子。32.项1-31中任ー项的方法，其中在步骤(e)中所述酶活性检测体系具有2_11， 优选6-10，更优选7-9的pH值。33.项1-32中任ー项的方法，其中在步骤(e)中检测所述胆碱酯酶的酶活性是通过PH測定法、电化学法或分光光度法检测的，优选是通过分光光度法检测的。34.项33的方法，其中在步骤(e)中加入5，5' _ ニ硫代双-(2_硝基苯甲酸) (DTNB)和硫代胆碱(TCh)以通过分光光度法检测所述胆碱酯酶的酶活性。35.项34的方法，其中通过分光光度法測定体系的吸光值变化速度，吸光值变化速度越快指示酶活性越高；反之，吸光值变化速度越慢指示酶活性越低。36.项1-35中任ー项的方法，其中在所述步骤(e)中測定的酶活性越高指示待测样品中农药的含量越低；反之，所述步骤(e)中測定的酶活性越低指示待测样品中农药的含量越高。37. ー种用于农药检测的便携式探測器，其包括电源系统、储存系统、控制系统和測定分析系统。38.项37的探測器，其中所述电源系统为电池(1)，其用于给探測器的其它各系统
、ο39.项37-38中任ー项的探測器，其中所述储存系统包括DTNB容器( 、硫代胆碱容器(6)、磁性纳米粒子溶液容器(1 以及用于富集和转移磁性纳米粒子的设置有磁体的磁体装置(14)。40.项39的探測器，其中所述磁体装置(14)包括外套(14a)和内部磁体(14b)， 其中所述内部磁体(14b)可从外套(14a)中移出。41.项40的探測器，其中所述外套(14a)是用玻璃或聚四氟乙烯制成的。42.项37-41中任ー项的探測器，其中所述控制系统包括与DTNB容器(5)相连用于控制DTNB的加入的按钮(3)、与硫代胆碱容器(6)相连用于控制胆碱酯酶的加入的按钮 (4)以及控制固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的释放的按钮(12)。
43.项37-42中任ー项的探測器，其中所述测定分析系统包括提供光谱检测所需波长的发光二极管(8)；与所述发光二极管(8)相连控制该发光二极管的芯片O)；经按钮 (3)与DTNB容器( 相连的、经按钮(4)与硫代胆碱容器(6)相连的、且可插入磁体装置 (14)的比色池(9)；用于将所采集的光信号转换成电信号的光电转换装置(10)；显示检测结果的液晶屏⑵以及分別与光电转换装置(10)和液晶屏(7)相连的数据处理芯片(11)。44.项37-43中任ー项的探測器，所述探测器是笔形探測器。45.使用项37-44中任一项的探测器检测农药的方法，其包括如下步骤(a)按下按钮(1 以使固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子的溶液接触待测样品；(b)利用磁体装置(14)富集样品中的磁性纳米粒子，将磁体装置(14)插入微型比色池(9)后，移出磁体装置(14)的内部磁体(14b)；(c)按下按钮(3)，将DTNB和磁体装置(14)的外套(14a)上的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子加入比色池(9)；(d)接通电源，待液晶屏上读数稳定后按下按钮以将乙酰硫代胆碱加入比色池中；和(e)通过测定分析系统根据比色池的颜色变化速度在液晶屏(7)上显示出样品中农药的浓度。46.项45的方法，其中步骤(a)进行1_5分钟，优选3分钟。47.项45的方法，其中步骤(b)中的富集进行10_60秒，优选30秒。48.项37-44中任ー项的探測器用于检测农药的用途。附图简述图1显示ATCh水解的化学方程式和TCh和DTNB之间的反应和TNB的UV-vis谱。图2显示通过固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的农药检测的示意性方法。图3显示通过磁体的磁性纳米粒子的再-收集。图4(a)显示在100°C沉淀的磁性纳米粒子XRD图样以及!7e304作为參比；图4(b) 显示磁性纳米粒子粉末的TG曲线。图5(a)显示磁性纳米粒子的UV-vis谱；图5(b)显示磁性纳米粒子浓度的标准曲线和在412nm的吸光度。图6 (a)显示在412nm扫描的反应的UV-vis谱；图6 (b)显示乙酰胆碱酯酶浓度的标准曲线和在反应开始时的斜率。图7(a)显示磁性纳米粒子的洗涤次数对于乙酰胆碱酯酶固定量的影响；图7(b) 显示PBS缓冲液的pH值对于乙酰胆碱酯酶固定量的影响。图8 (a)显示在PBS (pH = 7. 4)中加入的乙酰胆碱酯酶的体积对响应时间的影响； 图8(b)显示添加125 μ 1的乙酰胆碱酯酶(lU/ml)溶液的检测系统的pH值对乙酰胆碱酯酶活性的影响。图9显示游离的和固定化的乙酰胆碱酯酶的稳定性分析。
图10显示DTNB的稳定性分析(在环境温度储存40h)。图11显示乙酰胆碱酯酶对于以下不同农药的响应乐果、草甘膦、西维因、异丙威和马拉氧磷。图12显示固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的西维因抑制曲线。
图13显示在一定量的磁性纳米粒子溶液中固定乙酰胆碱酯酶吋，乙酰胆碱酯酶加入量与实际固定的酶量之间的关系(n = 3)。图14显示固定的乙酰胆碱酯酶量与PH值的关系(n = 3)。图15显示检测时的PH值对乙酰胆碱酯酶(游离态，未固定在磁性纳米粒子表面) 活性的影响图15(a)显示在不同ρΗ值的412nm处吸光度的变化，其中紫外-可见光分光光谱曲线的斜率随PH值的变化反映了酶活性随pH值的变化；图15(b)显示ρΗ值为2-11 时的酶活性曲线(其中的酶活性为相对于具有最高酶活性的点(PH = 9)进行归一化后的
inο图16显示了固定时聚合物的添加与乙酰胆碱酯酶固定量的关系(n = 3)。图17 (a)显示PDDA的加入对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用(乙酰胆碱酯酶浓度相同)；图17(b)显示乙酰胆碱被乙酰胆碱酯酶催化分解原理图。图18显示溶剂体系对乙酰胆碱酯酶固定量的影响(n = 3)。图19显示BSA对乙酰胆碱酯酶固定量的影响。图20显示乙酰胆碱酯酶活性检测的几种方法。图21显示乙酰胆碱酯酶催化ATCh分解引起的ρΗ值响应。图22显示电化学方法检测酶的活性。图23显示ATCh的加入量对电流的关系曲线。图M显示利用表面负载有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子进行农药检测示意图。图25显示不同温度下异丙威对乙酰胆碱酯酶的抑制率随反应时间的变化曲线。图沈显示三种利用乙酰胆碱酯酶检测农药含量方法间的对比。图27为显示检测装置的构造的图示。发明详述^X如本申请中所使用的术语“农药”意指在农业生产中，为保障、促进植物和农作物的成长，所施用的杀虫、杀菌、杀灭有害动物(或杂草)的物质统称。特指在农业上用于防治病虫以及调节植物生长、除草等药剂。农药按主用途不同可分为杀虫剂、杀螨剂、杀鼠剂、杀软体动物剂、杀菌剂、杀线虫剂、除草剤、植物生长调节剂等。农药按来源不同可分为矿物源农药(无机化合物)、生物源农药(天然有机物、抗生素、微生物)及化学合成农药等。矿物源农药是起源于天然矿物原料的无机化合物和石油的农药。它包括砷化物、硫化物铜化物、磷化物和氟化物，以及石油乳剂等。目前使用较多的品种有硫悬浮剂、波尔多液等。生物源农药是指利用生物资源开发的农药。它包括动物源农药(如杀虫双、烯虫酯、昆虫性引诱剂、赤眼蜂等)植物源农药(如除虫菊素、印楝素、丁香油、乙烯利等)和微生物源农药(井网霉素、白僵菌、苏云金杆菌等)。化学合成农药是由人工合成并通过化学エ业生产的农药，其品种多，应用范围广， 药效高。主要的化学合成农药包括有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、有机氮类农药、拟除虫菊酯类农药、有机氯类农药和有机氟类农药等。有机磷类农药具体包括磷酸酯、一硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、膦酸酷、磷酰胺、硫代磷酰胺、焦磷酸酯等。优选地，有机磷类农药的代表为草甘膦、乐果和马拉氧磷。氨基甲酸酯类农药具体包括N-甲基氨基甲酸酯类和ニ甲基氨基甲酸酯等。优选地，氨基甲酸酯类农药的代表为西维因和异丙威。纳米粒子如本申请中所使用的术语“纳米粒子”是指粒度在I-IOOnm之间的粒子，又称超细微粒。它们处于微观体系和宏观体系之间，是由数目不多的原子或分子組成的集団，因此纳米粒子具有表面积大、表面曲率大等物理化学特性，并具有体积效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应。磁件纳米粒子如本申请中所使用的术语“磁性纳米粒子”是指具有磁性的纳米粒子，也称磁性纳米材料。磁性纳米材料的特性不同于常规的磁性材料，其原因是与磁性相关的特征物理长度恰好处于纳米量级，例如磁单畴尺寸、超顺磁性临界尺寸、交換作用长度以及电子平均自由路程等大致处于I-IOOnm量级，当磁性体的尺寸与这些特征物理长度相当吋，就会呈现反常的磁学性质。举例而言，当磁性纳米粒子的粒径小于其超顺磁性临界尺寸吋，粒子进入超顺磁性状态，无矫顽カ和剩磁。众所周知，对于块状磁性材料(如!7e、Co、Ni)，其体内往往形成多畴结构以降低体系的退磁场能。纳米粒子尺寸处于单畴临界尺寸时具有高的矫顽力。小尺寸效应和表面效应导致磁性纳米粒子具有较低的居里温度。另外，磁性纳米粒子的饱和磁化強度(Ms)比常规材料低，并且其比饱和磁化强度随粒径的减小而减小。当粒子尺寸降低到纳米量级时，磁性材料甚至会发生磁性相变。本发明的磁性纳米粒子可通过本领域已知的常规方法制备，包括但不限于湿化学法、化学气相法和物理方法。其中所述湿化学法包括沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液及反相微乳液法、水热法和多元醇还原法等；所述化学气相法包括化学气相沉积法、化学气相凝聚法和等离子蒸发法等；所述物理方法包括蒸发冷凝法和磁控溅射方法等。參见，例如张效岩等，磁性材料及器件，第35卷第6期，2004年12月，第14-17页。本发明的磁性纳米粒子是合金、铁氧体和金属间化合物的磁性纳米粒子。优选地， 所述磁性纳米粒子是含铁、钴、镍及其合金的磁性纳米粒子，优选为!^e3O4的纳米粒子。在一个优选的实施方案中，所述磁性纳米粒子的表面X含有极性基团，优选柠檬酸根或羟基。胆碱酯酶如本申请中所使用的术语“胆碱酯酶”是指水解多种胆碱酯以生成胆碱与羧酸的酶。胆碱酯酶可分为真性胆碱酯酶和假性胆碱脂酶。真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶 (acetylcholinesterase, EC3. 1. 1. 7)，其为催化乙酰胆碱使其水解为胆碱和乙酸的酶且其催化活性能被有机磷类或氨基甲酸酯类农药所抑制，它主要来源于动物体内的胆碱能神经末梢突触间隙，特別是运动神经终板突触后膜的皱摺中聚集较多；也存在于胆碱能神经元内和红细胞中。优选地，所述乙酰胆碱酯酶源自电鳗或电鳐。此酶对于乙酰胆碱作用最強， 特异性也较高。假性胆碱酯酶包括丙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶等，其广泛存在于动物体内的神经胶质細胞、血浆、肝、肾、肠中。对乙酰胆碱的特异性较低，假性胆碱酯酶可水解其他胆碱酯类，如琥珀酰胆碱。雌如本申请中所使用的术语“固定”，也称固定化，是指用物理或化学方法使酶成为不易从载体上流失的形式。在本发明中，将胆碱酯酶(特別是乙酰胆碱酯酶)固定在磁性纳米粒子上的方法可使用本领域已知的各种常规方法来制备，所述常规方法包括但不限于吸附法、化学交联法、共价键合法、物理包理法、电化学聚合法和分子自组装等。參见，例如， 高盐生等，山东化工，2008年第37卷第4期，第21-22，30页。^^如本申请中所使用的术语“富集”是指以1. 1倍以上的因数高浓度地收集，具体地，本发明中的“富集磁性纳米粒子”的意思是收集所加入的全部纳米粒子的至少50%，优选至少60 %，更优选至少70 %，更优选至少80 %，还更优选至少90 %，如至少95 %、96 %、 97%、98%、99%，更优选至少99. 5%，最优选100%。酶活件检测法在本发明中，酶活性的检测可以采用光谱法，pH值测量法和电化学方法。如本申请中所使用的术语“光谱法”，也称分光光度法，是通过如下进行的胆碱酯酶与农药接触后受到农药的抑制而失活，加入DTNB+ATCh后，残余的胆碱酯酶可将乙酰硫代胆碱水解为硫代胆碱和乙酸，而DTNB与硫代胆碱反应以得到TNB，后者经由分光光度计检测在412nm具有最大吸收。在光谱法中，当412nm的吸光度值变化速度越快，说明TNB浓度增加越快，即硫代胆碱浓度増加越快，即酶活性高，即农药含量低；反之，吸光值变化速度慢，说明TNB増加慢，即硫代胆碱增加慢，即酶活性低，即农药含量高。由此，根据吸光度值的变化来确定待测样品中农药的存在或其含量。光谱法检测的检测速度快、灵敏度高，是优选的检测方法。如本申请中所使用的术语“pH值测量法”是通过如下进行的=ACh(ATCh)被乙酰胆碱酯酶水解后生成乙酸和胆碱(硫代胆碱)，因此，可通过检测由于反应生成乙酸而导致的溶液PH值的变化来检测乙酰胆碱酯酶的活性。为此，申请人分析了乙酰胆碱酯酶催化ATCh分解引起的pH值响应，如图21所示。 随着反应的进行，溶液的PH值会逐渐下降，但由于乙酰胆碱酯酶的活性与溶液的pH值密切相关(如图15所示)，pH值的下降会抑制乙酰胆碱酯酶的催化活性，溶液的pH值需要在比较长的时间内才能达到平衡(接近5小时)，因此检测pH值的变化无法实现快速检测。如本申请中所使用的术语“电化学方法”是通过如下进行的乙酰胆碱(乙酰硫代胆碱)被乙酰胆碱酯酶水解后生成乙酸和胆碱(硫代胆碱)，因此，可施加一定电压测定胆碱(硫代胆碱)的氧化电流(负向电流)来检测乙酰胆碱酯酶的活性。如图所示，在未加入乙酰胆碱酯酶时，循环伏安曲线上未出现明显的氧化峰，当加入乙酰胆碱酯酶后在0. 7V 附近出现了硫代胆碱的氧化峰。考虑到胆碱(硫代胆碱)上-OH官能团的氧化电位较高，检测时会造成较大的干扰，因此现有技术中在利用电化学方法进行检测时通常是利用乙酰硫代胆碱(ATCh)作为底物，ATCh被乙酰胆碱酯酶催化水解形成具有-SH官能团的硫代胆碱(TCh)，其氧化电位约为0. 7V。如图22所示，根据0. 7V氧化电流的大小可以计算出溶液中TCh的含量，从而可以知道乙酰胆碱酯酶的活性，进而根据乙酰胆碱酯酶的抑制率推断出农药的含量。如图23 所示，随着ATCh加入量的増大，更多的TCh被水解出来，因此0. 7V处的氧化电流増大。相对于检测PH值响应，电化学方法可以实现更快速的响应。如图23所示，响应时间约为40 秒，但相对于光谱检测方法，电化学检测方式的灵敏度较差，需要消耗大量的乙酰胆碱酯酶和ATCh，増加了检测成本。
此外，需要着重强调的是，本发明的分光光度法与现有技术中所使用的检测方法(包括用酶液直接检测吸光度的方法，以及电极负载磁性纳米粒子和乙酰胆碱酯酶的检测方法)相比有显著的优势，这些优势至少体现在如下方面1.与用酶液直接检测吸光度的对比用酶液直接检测吸光度指的是直接将游离态的乙酰胆碱酯酶溶液(假定酶溶液浓度为A，加入体积为Vaqie)与待测液(含有农药，体积为Vas)混合进行酶抑制反应，充分反应后取若干体积的上述溶液(νΛλ)到一定体积的DTNB溶液中(VDTNB)，最后加入ATCh(VATCh)进行光谱检测。由于在此过程中乙酰胆碱酯酶的浓度被逐渐稀释，待检测的信号源被减弱，根据计算可知光谱检测时乙酰胆碱酯酶的浓度为
权利要求
1.一种检测农药的方法，包括如下步骤(a)提供待测样品；(b)制备磁性纳米粒子，使胆碱酯酶与所述磁性纳米粒子接触，从而得到固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子；(c)向步骤(a)的所述待测样品中加入步骤(b)中得到的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子，并温育；(d)用磁场富集磁性纳米粒子；和(e)去除磁场，将富集的磁性纳米粒子分散在酶活性检测体系中，检测所述胆碱酯酶的酶活性，并通过酶活性来确定待测样品中农药的存在或其含量。
2.权利要求1的方法，其中所述农药为化学合成农药。
3.权利要求1的方法，其中所述农药选自下组有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、有机氮类农药、拟除虫菊酷类农药、有机氯类农药和有机氟类农药。
4.权利要求3的方法，其中所述有机磷类农药选自下组磷酸酯、一硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酯、膦酸酷、磷酰胺、硫代磷酰胺、焦磷酸酷。
5.权利要求3的方法，其中所述有机磷类农药选自草甘膦、乐果和马拉氧磷。
6.权利要求3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自下组N-甲基氨基甲酸酯类和 ニ甲基氨基甲酸酷。
7.权利要求3的方法，其中所述氨基甲酸酯类农药选自西维因和异丙威。
8.权利要求1-7中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子是通过选自下组的方法制备的湿化学法、化学气相法和物理方法。
9.权利要求8的方法，其中所述湿化学法选自沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液及反相微乳液法、水热法和多元醇还原法；所述化学气相法选自化学气相沉积法、化学气相凝聚法和等离子蒸发法；所述物理方法选自蒸发冷凝法和磁控溅射方法。
10.权利要求1-9中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子是合金、铁氧体和金属间化合物的磁性纳米粒子。
11.权利要求1-10中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子是含铁、钴、镍及其合金的磁性纳米粒子，优选为Fi53O4的纳米粒子。
12.权利要求1-11中任ー项的方法，其中所述磁性纳米粒子的表面含有极性基团，优选柠檬酸根或羟基。
13.权利要求1-12中任ー项的方法，其中所述胆碱酯酶选自下组乙酰胆碱酯酶、丙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶。
14.权利要求13的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶从选自下组的来源获得微生物、植物和动物，优选电鳗或电鳐。
15.权利要求1-14中任ー项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准磁性纳米粒子的步骤，优选通过标准曲线进行。
16.权利要求1-15中任ー项的方法，其中在步骤(b)之前还包括校准胆碱酯酶浓度的步骤，优选通过标准曲线进行。
17.权利要求1-16中任ー项的方法，其中在步骤(b)之前还包括洗涤磁性纳米粒子的步骤，优选用去离子水洗涤1-5次，更优选洗涤4次。
18.权利要求1-17中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过选自下组的方法进行的吸附法、化学交联法、共价键合法、物理包理法、电化学聚合法和分子自组装。
19.权利要求1-18中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是在PH 6-8，优选pH 7的条件下进行的。
20.权利要求1-19中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上的过程中，加入胆碱酯酶与磁性纳米粒子的比例为20 330 lU/g，优选125 320 lU/g，更优选 250 310 lU/g，更优选沘0 lU/g。
21.权利要求1-20中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的(A)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；(B)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的去离子水或磷酸盐缓冲溶液中；和(C)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。
22.权利要求1-21中任ー项的方法，其中在步骤(b)中将胆碱酯酶固定在磁性纳米粒子上是通过如下进行的(a)将磁性纳米粒子悬浮于去离子水中；(b)将所述胆碱酯酶溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液；和(c)将磁性纳米粒子溶液与胆碱酯酶溶液接触。
23.权利要求21-22中任ー项的方法，其中磁性纳米粒子溶液的浓度为0.l-10g/L，优选0. 5-5g/L，更优选l-3g/L，更优选约2g/L。
24.权利要求21-22中任ー项的方法，其中胆碱酯酶溶液的浓度为0.l-10U/ml，优选 0. 5-2U/ml，更优选 lU/ml。
25.权利要求21-22中任ー项的方法，其中牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为 0. l_5g/L，优选 0. 5-2g/L，更优选 0. 8-1. 2g/L，更优选 lg/L。
26.权利要求1-25中任ー项的方法，其中在步骤(c)中向所述待测样品中加入 0. 05-lml，优选0. 1-0. 5ml，更优选0. 25ml固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液。
27.权利要求1マ6中任ー项的方法，其中在步骤(c)中将待测样品与固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子在0-60°C，优选20-50°C，更优选40°C，温育2分钟-2小吋，优选20分钟-1 小吋，更优选40分钟。
28.权利要求1-27中任ー项的方法，其中在步骤(d)中通过覆有外层的磁体富集磁性纳米粒子。
29.权利要求28的方法，其中所述磁体的直径为约2-10mm，优选3_8mm，更优选4mm。
30.权利要求1- 中任ー项的方法，其中所述步骤(d)进行1-10分钟，优选1-5分钟， 更优选100秒。
31.权利要求1-30中任ー项的方法，其中在步骤(d)中富集至少60%，优选至少80%， 更优选至少90%，更优选基本上100%的磁性纳米粒子。
32.权利要求1-31中任ー项的方法，其中在步骤(e)中所述酶活性检测体系具有 2-11，优选6-10，更优选7-9的pH值。
33.权利要求1-32中任ー项的方法，其中在步骤(e)中检测所述胆碱酯酶的酶活性是通过PH測定法、电化学法或分光光度法检测的，优选是通过分光光度法检测的。
34.权利要求33的方法，其中在步骤(e)中加入5，5'- ニ硫代双-(2-硝基苯甲酸) (DTNB)和硫代胆碱(TCh)以通过分光光度法检测所述胆碱酯酶的酶活性。
35.权利要求34的方法，其中通过分光光度法測定体系的吸光值变化速度，吸光值变化速度越快指示酶活性越高；反之，吸光值变化速度越慢指示酶活性越低。
36.权利要求1-35中任ー项的方法，其中在所述步骤(e)中測定的酶活性越高指示待测样品中农药的含量越低；反之，所述步骤(e)中測定的酶活性越低指示待测样品中农药的含量越高。
37.ー种用于农药检测的便携式探測器，其包括电源系统、储存系统、控制系统和测定分析系统。
38.权利要求37的探測器，其中所述电源系统为电池(1)，其用于给探測器的其它各系统供电。
39.权利要求37-38中任ー项的探測器，其中所述储存系统包括DTNB容器(5)、硫代胆碱容器(6)、磁性纳米粒子溶液容器(1 以及用于富集和转移磁性纳米粒子的设置有磁体的磁体装置(14)。
40.权利要求39的探測器，其中所述磁体装置(14)包括外套(14a)和内部磁体(14b)， 其中所述内部磁体(14b)可从外套(14a)中移出。
41.权利要求40的探測器，其中所述外套(14a)是用玻璃或聚四氟乙烯制成的。
42.权利要求37-41中任ー项的探測器，其中所述控制系统包括与DTNB容器(5)相连用于控制DTNB的加入的按钮(3)、与硫代胆碱容器(6)相连用于控制胆碱酯酶的加入的按钮以及控制固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子溶液的释放的按钮(12)。
43.权利要求37-42中任ー项的探測器，其中所述测定分析系统包括提供光谱检测所需波长的发光二极管(8)；与所述发光二极管(8)相连控制该发光二极管的芯片O)；经按钮(3)与DTNB容器( 相连的、经按钮(4)与硫代胆碱容器(6)相连的、且可插入磁体装置 (14)的比色池(9)；用于将所采集的光信号转换成电信号的光电转换装置(10)；显示检测结果的液晶屏⑵以及分別与光电转换装置(10)和液晶屏(7)相连的数据处理芯片(11)。
44.权利要求37-43中任ー项的探測器，所述探测器是笔形探測器。
45.使用权利要求37-44中任一项的探测器检测农药的方法，其包括如下步骤(a)按下按钮(1 以使固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子的溶液接触待测样品；(b)利用磁体装置(14)富集样品中的磁性纳米粒子，将磁体装置(14)插入微型比色池 (9)后，移出磁体装置(14)的内部磁体(14b)；(c)按下按钮(3)，将DTNB和磁体装置(14)的外套(14a)上的固定有胆碱酯酶的磁性纳米粒子加入比色池(9)；(d)接通电源，待液晶屏上读数稳定后按下按钮(4)以将乙酰硫代胆碱加入比色池中；和(e)通过测定分析系统根据比色池的颜色变化速度在液晶屏(7)上显示出样品中农药的浓度。
46.权利要求45的方法，其中步骤(a)进行1-5分钟，优选3分钟。
47.权利要求45的方法，其中步骤(b)中的富集进行10-60秒，优选30秒。
48.权利要求37-44中任ー项的探測器用于检测农药的用途。
全文摘要
本发明涉及使用胆碱酯酶检测农药的方法和装置。具体地，本发明涉及一种基于固定有乙酰胆碱酯酶的磁性纳米粒子的新型农药检测方法，其中所述磁性纳米粒子充当载体以收集溶液中的乙酰胆碱酯酶。本发明还涉及采用上述方法的用于农药检测的便携式笔形探测器。
文档编号C12Q1/46GK102586399SQ20111002043
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者丁宁, 李勇明, 梶浦尚志 申请人:索尼公司