专利名称：一种HIV-1 CRF07BC gp41多肽疫苗设计及其制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及到分子生物学，氨基酸点突变、结构生物学和蛋白质表达纯化等技木，特别是HIV gp41第559、560和563位点的突变。
背景技术：
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，简称 AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，简称HIV)感染所导致的ー种病死率极高的慢性传染病，正在全球肆虐。全球艾滋病病毒感染者人数已经达到3330万，死亡2500万，2009年新增艾滋病病毒感染者500万，其中成人达到430万，320万人因艾滋病死亡。目前艾滋病的治疗和预防并没有非常有效的措施，治疗主要集中在抗病毒治疗而预防则主要是宣传教育和切断HIV传播途径。目前临床上所用的抗病毒药物主要包括逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、HIV进入/融合抑制剂、整合酶抑制剂等等，虽然高效抗逆转录病毒疗法(highly active anti-retroviraltherapy,HARRT)在临床上取得了很好的效果，但是抗病毒药物的使用引起了 HIV基因的突变，进而产生抗药性和耐药性，远期治疗效果并不是很肯定；并且由于艾滋病感染人数巨大，且大都集中在发展中国家，多数AIDS患者支付不起昂贵的抗病毒药物治疗，因此抗病毒治疗并不能有效地控制AIDS的传播。切断HIV传播的途径虽然对预防HIV感染有重大意义，但是不能从根本上解决艾滋病的致病性问题。由于疫苗在疾病的预防和治疗中发挥了重要的作用，因此自AIDS发现之日起，人们就一直尝试研制ー种艾滋病疫苗来控制和预防HIV感染，如灭活疫苗、减毒活疫苗、病毒颗粒样(VLP)疫苗、重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗等。目前已有近40种HIV疫苗进入临床试验但是均未达到预期的效果。分析这些疫苗失败的主要原因是HIV高度遗传变异性所致，因此以HIV 为靶标的疫苗设计和研制目前仍在困境之中。随着对HIV感染机制研究的深入，HIV包膜蛋白gp41为新型抗病毒药物和HIV疫苗的研制提供了新的靶点。Gp41是HIV —个重要的包膜蛋白，gp41平时镶嵌在包膜内，当gpl20与⑶4分子结合吋，gpl20发生构象变化，暴露出HIV辅助受体的结合位点，在与辅助受体结合后，gp41介导HIV与CD4的細胞融合，从而使HIV感染核心进入細胞内。Gp41参与HIV与細胞膜融合的过程，是早期HIV进入細胞所需要的重要分子之一。因此，近年来以gp41为靶点的抗HIV策略越来越受到重视，其中包括gp41拮抗剂、gp41单克隆抗体、RNAi干渉、gp41自体疫苗等。Gp41抗体稳定而持久， 对HIV的诊断和治疗有重要意义。因此，寻找和设计高效的gp41免疫原成为研究的热点和难点。其中，以gp41三级结构为基础的免疫原为设计和研制新型AIDS疫苗提供了一条新的思路。gp41分子和HIV感染的关系1抗HIV感染新的靶点_gp411. Igp41 的功能HIV gp41是HIV的跨膜糖蛋白，其功能为介导HIV包膜与靶細胞膜的融合，在病毒进入靶細胞的早期阶段发挥关键的作用。因此，HIV gp41可以作为开发抗HIV药物的一个新靶点。Gp41的胞外区存在N-末端重复序列(NHR)和C-末端重复序列(CHR)，他们相互作用能形成六螺旋束结构，将HIV包膜与靶細胞膜拉近，介导两者的融合，最终实现HIV的感染过程。1. 2HIV gp41 的结构Gp41为HIV包膜蛋白的跨膜亚基，其包膜外区含有三个功能区(1).位于gp41 N 末端的融合多肽；(2).位于融合多肽下游的N-末端重复序列(NHR) ； (3).位于gp41包膜外区C-末端的重复序列(Offi)。NHR和CHR含有能形成螺旋结构的疏水氨基酸序列，他们是gp41形成多聚体及介导膜融合的功能性结构。HIV gp41的X-射线衍射分析表明，其核心结构为六股α -螺旋束，其中三个NHR組成的N-螺旋相互作用，形成位于中心的螺旋三聚体，而三个CHR組成的C-螺旋以反向平行的方式结合在由三个N-螺旋形成的沟槽中， 该沟槽中含有由疏水残基构成的深穴。HIV gp41亚基核心结构中的这一“深穴”被认为是研究阻断HIV与靶細胞融合药物作用的新靶点。目前申请人课题组已经成功解析了 HIV CRF07BC(中国境内流行的HIV亚型)gp41的晶体结构(附图1)。1. 3 EIAV gp45 的结构(Equine infectious anemia virus, EIAV) % HIV
属，是感染马类的免疫缺陷病毒，可以作为研究HIV的模式病毒。在上世纪70年代，通过沈荣显院士及其团队的艰苦努力，EIAV的疫苗已经研制成功，并成功应用到EIAV的防治中。 这项巨大的成就为人类研制艾滋病疫苗提供了基础。申请人:课题组在世界上第一次解析了 EIAV病毒株(野生株)和疫苗株gp45(相应于HIV的gp41)的晶体结构(附图2)，通过比较二者的不同，我们找到了一些在疫苗株中存在的特异的突变位点，这些位点构成了疫苗株病毒能够引起宿主免疫反应，但是又不致病的结构机理。通过对这些结构的比较和分析，我们设计了 HIV CRF07BC gp41的免疫原多肽，希望将此多肽应用于抗艾滋病的疫苗设计中。EIAV gp45的晶体结构整体上与HIV gp41相似，也是有六股α -螺旋构成。由于这两种病毒同属慢病毒属，这种结构上的相似在意料之中，这也为我们将EIAV gp45疫苗株的结构信息应用到HIV gp41的设计上提供了结构基础。2以HIV gp41为靶点的抗HIV药物研究进展越来越多的研究表明，gpl20的变异性很大，作为HIV疫苗和药物作用的靶点有较大的局限性。Gp41序列比gpl20更为保守，并且与人体自身蛋白没有同源性，是病毒特有蛋白。因此，gp41被认为是更适合作为研究抑制HIV与靶細胞融合的药物作用靶点。2.1多肽类融合抑制剂以Roche制药公司开发的T_20作为HIV与靶細胞融合过程的第三类抗艾滋病药物，即HIV进入抑制剂。Τ-20単独或与其他抗HIV药物合用，疗效均非常显著，对那些已对现有抗HIV药物出现耐药反应的患者也有良好疗效，且无明显毒副作用。Τ-20在HIV进入抑制剂中最先研制成功也表明gp41作为抗艾滋病药物的作用靶点具有明显的优越性和合理性。“5-helix”蛋白具有很好的溶解性，也不发生聚集，能与gp41的CHR区结合并具有很强的抑制HIV与靶細胞融合和HIV复制的活性，证明CHR区也是抗HIV药物开发的ー个重要靶位。“5-helix”可通过基因工程手段大量获得，作为药物进行开发，也可望用于艾滋病基因治疗和疫苗开发。但是，上述的T-20和5-Helix等均为多肽类或蛋白类抗HIV，药物，分子量大，容易被内源性蛋白酶降解，不能ロ服，而且用量大(T-20毎日注射剂量200mg)，合成的成本高， 药品价格高昂O0000美元/病人/年)。另外，肽类还可能导致机体产生抗体，降低药物疗效，诱发免疫复合物反应。因此，人们希望找到作用HIVgp41的一些非肽类的小分子化合物，用于HIV感染和艾滋病的治疗。2.2小分子融合抑制剂RPR103611和IC9564是由白桦酯酸及其衍生物发展而来的HIV进入抑制剂，抗病毒活性在IOnM量级。对这类抑制剂的作用机理的研究表明，RPR103611和IC9564很可能通过破坏gpl20-gp41复合物的稳定性而发挥抗病毒作用。除此之外，还有单克隆抗体、基因治疗等针对gp41的治疗手段也在尝试阶段。
发明内容
本发明的目的在干，设计和表达了ー种来自HIV-I gp41的突变体的自体多肽疫苗，其特征在干，參考EIAV疫苗株的序列，对野生株HIV-I CRF07BC gp41的三个关键氨基酸进行突变，突变位点为A559S，I560M，Q563T，得到了针对HIV gp41的多肽疫苗，所述的免疫多肽的氨基酸序列如下SGIVQQQNNLLRSMEATQHLLQLTVWGIKQLQARVLGGSGGWMQWEKEIDNYTGLIYRLIEESQTQQEK NEQDLL。为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是运用结构生物学方法，比较 EIAV野生株和疫苗株gp45 —级结构和三级结构的不同，找到了影响毒株差异的三个重要的氨基酸，分别是A559、1560和Q563，然后通过比较HIV野生株gp41与EIAV野生株gp45 的序列和结构，分析他们之间的同源性，通过点突变的方法得到类似EIAV疫苗株gp45的 HIV gp41，用于诱导产生针对gp41的抗体。上述gp41自体多肽疫苗的制备方法，其特征在干，根据gp41的结构应用 linker (GGSGG)将NHR和CHR连接起来，运用overlap PCR获得了此表达序列，并克隆入 PET30原核表达载体，转化大肠杆菌，在大肠杆菌中高效表达，经过Ni-NTA亲和层折、离子交換层析和分子筛层析等纯化，即可获得纯化的目的蛋白gp41疫苗多肽，理论上该疫苗可以诱导机体产生特异性的抗HIV抗体。
图1是HIV-I CRF07BC gp41的三维结构图。 图2是EIAV gp45的三维结构图。
具体实施例方式实施例HIV-1 CRF07BC gp41多肽疫苗的表达和纯化步骤一、Gp41表达质粒的构建运用PCR点突变的方法将野生株HIV gp41突变为需要的gp41模板，突变位点为 A559S、I560M和Q563T。然后截取NHR和CHR氨基酸序列，应用柔性linker连接，获得模拟 EIAV疫苗株gp45的HIV gp41。截取的氨基酸序列和linker序列如下
SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVffGIKQLQARVL 为 NHR 序列；WMQffEKEIDNYTGLIYRLIEESQTQQEKNEQDLL 为 CHR 序列；
GGSGG 为 NHR 和 CHR 之间的 1 inker。其中用到的点突变引物为，上游引物CAGCAGAGCAACCTGCTGAGGTCCATGGAGGCCACGCAGCACCTGCTGCAG下游引物CTGCAGCAGGTGCTGCGTGGCCTCCATGGACCTCAGCAGGTTGCTCTGCTG通过PCR扩增的方法获得突变后的gp41片段，连接到pET30表达载体中，经过酶切和测序鉴定正确后，获得含有gp41融合基因的原核表达载体pET30-gp41。其中用到的扩增引物为，上游引物TACTTCCAATCCAATGCCAGCGGCATCGTGCAG下游引物TTATCCACTTCCAATGCTACAGCACCCTGGTCTGCAG步骤ニ、感受态细胞的制备BL21种子菌株涂布无抗性LB琼脂平板，37°C过夜培养后，挑取单菌落到3ml无抗性LB培养基中37°C，200rpm摇菌过夜。按接菌量到50ml LB，37°C摇到OD = 0. 3 0. 4 (Ih左右)，转入无菌离心管，4°C 5000rpm 5min,弃上清，倒置使剰余液体流尽。加入 15ml的0. IM CaC12(存放于4°C冰箱中，直接倒，大概15ml即可)轻轻晃动管，致使细胞悬浮，至冰上10 30rnin，5000rpm 4°C 5min回收细胞(离出的菌体应成圆环状)，弃上清， 在加2ml冰冷的0. IM CaCl2悬浮細胞，每管IOOul分装到无菌印pendorf管中，-70°C保存步骤三、表达质粒pET30_gp41的转化、培养加40ng pET30-gp41质粒到IOOul感受态中，混合均勻，冰浴30min。42°C热休克 90s，迅速放入冰里(此步最为重要)，将管插入冰中，冷却1 aiiin后，每管加入800ul无抗性LB培养基中。37°C，70rpm/min，培养45min，让细菌中的质粒表达抗性蛋白。4000rpm 5min去上清，余下100 200ul，涂布Kan (Kan,卡那霉素)的LB平板。正放平板20 30min， 倒置37°C温箱中培养12 16h。步骤四、gp41蛋白的表达纯化挑取BL21单菌落于IOml LB培养基(50 μ g/ml Kan)中，37°C振荡培养；将IOmL菌液转移至IL LB培养基(50 μ g/ml Kan)中，37°C 220rpm振荡培养3_4h，当OD6tltl达0. 8 1.0时，加入0. IM IPTG诱导，16°C过夜诱导；6000rpm 15min收集菌体，菌体加入用40ml裂解液重悬，用微量移液器或吸管轻吹，确保重悬菌液中无明显可见的团块。打超声前才加入溶菌酶至0. lmg/ml ；超声破碎菌体至菌液变澄清为止。4°C 18000rpm离心40min，上清过镍柱，上样完成后，分别用含OmM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM、以及IM咪唑的平衡液进行梯度洗脱，收集穿透液，并用SDS-PAGE电泳分析(15%分离胶)。对含有gp41的组分浓縮，进ー步进行离子交換层析和分子筛层析等步骤进行纯化。步骤五、目的蛋白的鉴定将纯化得到的gp41蛋白跑15%的SDS-PAGE胶，每孔2ug gp41 (根据纯化的gp41 的量进行调节)。在预冷的转移缓冲液05mM Tris,200mM Glycine，20%甲醇)中，100V 稳压电泳70min，将蛋白转移至PVDF膜上。在5%的脱脂奶粉中封闭45min。用小鼠抗人 gp41 单克隆抗体(1 1000 稀释)孵育 PVDF 膜，室温 1. 5h，TBST (20mM Tris, 150mM NaCl, pH8. 0,0. 05% Tween20)洗膜3次，再以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1 10000稀释)孵育PVDF膜，室温45min，TBST洗膜3次。加入HRP发光底物曝光。Western blotting结果显示，表达纯化得到的蛋白确实为突变后的gp41。
权利要求
1.一种来自Hiv-I gp41的突变体的自体多肽疫苗，其特征在干，參考EIAV疫苗株的序列，对野生株HIV-I CRF07BC gp41的三个关键氨基酸进行突变，突变位点为A559S，I560M， Q563T，得到了针对HIV gp41的多肽疫苗，所述的免疫多肽的氨基酸序列如下SGIVQQQNNLLRSMEA1QHLLQLTVWGIKQLQARVLGGSGGWMQWEKEIDNYTGLIYRLIEESQTQQEKNEQDLL。
2.根据权利要求1所述的gp41多肽疫苗的制备方法，其特征在于，应用点突变和 overlapPCR等技术获得多肽疫苗表达序列，并克隆入pET30原核表达载体，转化大肠杆菌， 在大肠杆菌中获得高效的可溶性表达，经过M-NTA亲和层折、离子交換层析和分子筛层析获得了高纯度的gp41蛋白。
3.根据权利要求1所述的三个突变位点设计方法，其特征为基于申请人自己解析的高分辨率的晶体结构而设计，具体为A559S，I560M, Q563T。
4.根据权利要求1所述的三个突变位点A559，1560，Q563，其特征为HIVgp41的第 559，560，563位氨基酸的突变。并在此基础上已经获得的其它几种有效突变，如下A559T， I560S, Q563E ；A559G, I560H, Q563I ；A559H, I560S, Q563C。
全文摘要
本发明公开了一个针对HIV-1 gp41的多肽疫苗设计及其制备方法。该多肽疫苗是通过比较EIAV的致病株和疫苗株的gp45在一级结构和三级结构上的不同，找到两个毒株gp45结构上的差异，获得EIAV疫苗株产生的结构基础，并通过分析HIV-1 CRF07BC gp41一级结构和三级结构，在HIV gp41中模拟EIAV在减毒过程中产生的天然突变位点，表达了用来作为HIV gp41免疫原的多肽疫苗。该多肽以HIV gp41为主体，通过突变gp41上的三个关键位点而得到，三个突变位点分别为A559S、I560M和Q563T。通过PCR方法得到构建好的HIV gp41多肽疫苗表达序列，克隆入pET30原核表达载体，转化大肠杆菌并高效表达，并经过WB免疫印迹实验验证其表达效果。此设计为构建新型的gp41多肽疫苗和其它艾滋病疫苗奠定了一定的基础。
文档编号C12N15/70GK102580078SQ20111002025
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月18日 优先权日2011年1月18日
发明者刘新奇, 孙佩龙, 杜建森 申请人:南开大学