细菌菌株的组合物、生物除污混合物和该组合物用于从土壤中去除污染物的用途以及用 ...的制作方法
【专利说明】细菌菌株的组合物、生物除污混合物和该组合物用于从土 壤中去除污染物的用途以及用于净化土壤污染物的方法
[0001] 说明书。
技术领域
[0002] 本发明涉及以编号KKP 2041P保藏的由11种菌株组成的组合物：寡养单胞菌 属种sp.)菌株2L、寡养单胞菌属种菌株5L、寡养单胞菌属种菌株 6L、寡养单胞菌属种菌株3N、无色杆菌属种sp.)菌株4P、节杆菌属种 ClriAroAacier sp.)菌株1N、短波单胞菌属种sp.)菌株2N、短波单胞菌 属种菌株5N、短波单胞菌属种菌株6N、假单胞菌属种sp.)菌株3G、和假单胞 菌属种菌株4G，包含这些菌株的组合物的生物除污菌苗（生物除污混合物），其从土壤中去 除污染物的用途，以及土壤处理的方法。
【背景技术】
[0003] 工业的不断发展涉及在正常条件下在那里不会存在的化合物在环境中的出现。目 前，硝基化合物属于主要类型的人为污染，其中硝基苯、2-和4-硝基甲苯、3-硝基甲苯、 4_硝基苯酚、3-硝基苯酚和对硝基苯胺值得特别注意。它们用于制造炸药，用于杀虫剂和 除草剂生产，作为染料、塑料、涂料的合成以及制药工业中的底物。据估计，世界上每年生产 约IO 8吨有机硝基化合物，并且多于8. 5吨的硝基苯单独地被释放到环境中。近80年来， 这些化合物在许多工业分支以及在上世纪前半世纪连同两次世界大战中大量军事材料和 弹药的生产中的广泛使用已经导致硝基化合物对环境的严重污染。前述类型的化合物和它 们的代谢物对人具有高度毒性和危险性。它们中的一些是烈性毒药，经常伴有强烈致突变 和致癌特性。大多数芳香族硝基化合物的特征在于它们在生物系统中的稳定性和持久性和 它们对降解的相当抗性（Kulkarni和Chaudhari, 2007)。
[0004] 额外关注是，硝基化合物对土壤的污染还直接威胁地下水，并且因此可导致这些 污染物渗入流水中这一事实。来自各个工业分支的有机化合物污染土壤和地下水的问题， 不仅涉及波兰和其它欧盟国家，而且实际上涉及世界上所有工业化国家。在波兰和世界各 地，这些化合物污染环境的问题主要涉及化工厂（在那里它们被用作有机合成中的底物） 周围的区域，以及军事基地（在那里它们被保持和储存）的区域。
[0005] 存在几种物理-化学中和硝基化合物的常规方法，诸如氧化和光氧化，水解，蒸 发，燃烧，吸附等（Kanekar等人，2003)。然而，此类方法具有许多缺点和限制。燃烧不是 成本节约的，且不是环境友好的。此外，其伴随相当量的毒性气体释放到环境中。在此类 程序诸如过滤、萃取或吸附在树脂上的过程中，仅分离不需要的化合物，并且这不会导致 其降解。同时，氧化过程使得形成毒性衍生物，且与高成本相关（Kulkarni和Chaudhari, 2007)。
[0006] 开发了基于物理、化学和生物方法的几种土地除污策略。然而，据信，最便宜且最 有效的并因此是安全的生物除污技术是利用微生物的代谢潜能的技术。
[0007] 生物除污是修复的过程，其中，微生物诸如细菌、酵母和丝状真菌用于将有害物质 分解为低毒性或无毒性化合物。
[0008] 为了生物除污过程的目的，微生物分离自污染环境中存在的天然微生物区系（再 接种），或通过基因工程的方法获得。在实践中，在生物降解过程中，涉及显示降解某些烃 基的特定能力的专门试剂盒（微生物的共生体（consortia))。此类共生体，除了高解毒活 性，必须迅速适应被污染的环境，与土著微生物区系合作，且不积累毒性分解中间体。
[0009] 可以区分两种类型的微生物制剂：含有外部来源菌株的制剂，和含有使用各种方 法从处理的土壤分离的有效土著菌株的自身菌苗（autovaccine)。
[0010] 专利PL 180 141公开了微生物除污石油污染的土壤的方法，其中利用从意欲经 历处理的土壤分离的土著微生物。使分离的细菌菌株在补充石油烃的液体矿物培养基中在 有氧条件下生长，并且鉴定之后，选择在降解这些污染物中具有最高活性的细菌。使选择的 5至10种不同种类的细菌在26°C生长48至72小时。通过以大于IO 5个细胞/I g干燥土 壤用细菌的含水悬浮液喷洒而将繁殖的培养物引入污染的土壤。
[0011] 专利PL 189 586公开了制备加速被石油污染的土壤和废水的处理的自身菌苗的 方法，其依赖于通过稀释和在富含作为唯一碳源的无菌原油或萘的培养基中选择性培养而 从土壤和废水中分离细菌。
[0012] 土壤中芳香族硝基化合物，特别是硝基苯胺、硝基苯和硝基苯酚的延长存在起始 了自然适应和在污染区域中选择微生物的过程，其影响微生物的质量以及土著（对于给定 生态系统是天然的）组的物种组成。除了负责降解给定芳香族硝基化合物的微生物的精确 知识，有效的生物除污需要，在生理、生化和分子水平上理解这些化合物的降解途径，以及 关于流畅运行生物除污过程必要的条件优化的研究。本技术方案的作者已经实施了此类研 究。
[0013] 在来自军事用地（如军事训练场地）和工业化地区的土壤中，非常经常报道不仅 各种有机异生素，而且还有重金属，诸如砷、镉、铬、铜、铅、汞、镍、锌等的高浓度（Bahig和 Altalhi，2009年）。重金属被认为是有机异生素生物降解过程的有效抑制剂（Silva等 人，2007)。据认为，工业废水中重金属的存在是限制使用生物除污方法的主要因素之一 (Kulkami和Chaudhari, 2007)。然而，环境中这些污染物的长期存在，导致细菌发展出解 毒这些化合物的机制。此外，暗示微生物对重金属的耐受性可以通过增加环境的选择压力 而影响细菌之间的抗生素抗性基因的维持和传递（Spain，2003)。还存在细菌对许多临床 上重要种类的抗菌药物、重金属和用作消毒剂的季铵化合物的抗性之间的关联的证据。在 许多情况下，这涉及在相同细菌质粒上密切邻近的确定这些抗性的基因的位置，这表明通 过水平基因转移传递整个基因簇的可能性（Schluter等人，2007)。
[0014] 存在许多关于生物除污各种异生素（例如原油及其衍生物）污染土壤的过程的研 究，但是，在本领域的当前状态中，没有关于使用被芳香族硝基化合物污染的区域的原地生 物除污的的研究。在关于环状硝基化合物的生物降解的专业文献中，仅仅已经在实验室规 模上考虑和分析了该问题。硝基化合物（特别是硝基苯胺）生物降解的有效方法的应用似 乎是许多方面中的最佳技术方案，这主要是因为这些是环境中天然存在的过程，而且，非常 重要的是，它们是非常有效的并且与比传统方法诸如物理-化学技术更低的成本相关。
[0015] 波兰专利PL 380 007公开了土壤生物除污和预防具有有机物质的污染传播的方 法，其基于将固定化形式的酵母种解脂耶罗维亚酵母（Farroria 引入土壤中。 以有机介质（其是海藻酸钠、琼脂、明胶、胶原蛋白或鸟羽毛）上菌苗（生物制剂）的形式 使用原地方法将酵母直接引入污染区域或它们周围。液体或干燥形式的菌苗可以作为颗粒 剂或生物膜或生物胶引入，且酵母构成菌苗的5至50%(以质量计），其中菌苗可以构成引入 土壤中的材料的10至100%。在保护水体的情况下，在海岸线附近、超出波浪到达之处，根 据地下水流的方向，将菌苗以0. 1至2 m的深度置于直径为0. 1至I. 0 m的孔中，而它们的 分布可以是直线的或横向重叠或同轴或环绕给定区域或位于其最低点。本发明尤其可用于 被石油化合物、石油工业废弃物、植物和矿物油污染的地区。
[0016] 发明的公开 本技术方案是从环境去除有害污染物而不向其中引入任何合成产品的自然方法。原地 生物除污基于在环境中发生的自然过程，这与比常规物理-化学方法低得多的成本相关。 开发且保藏的菌株组合物（菌苗）促进在短时间内快速获取适当量的制剂和进行生物除 污。
[0017] 作为生物除污菌苗组合物（这是本发明的目标）的部分的细菌菌株能够降解/代 谢芳香族硝基化合物和，通常，芳香族化合物，诸如酚类、氨基苯酚、硝基苯酚以及多环芳香 族化合物，其可以由这些微生物用作碳和能量的唯一来源。此外，所述菌株能够在高浓度的 重金属存在的情况下生长（并且在被有机硝基化合物或石油污染的土壤的情况下也存在 重金属）。它们同时，能够在高浓度的抗生素存在的情况下生长（在制药公司附近或额外被 抗生素或它们的代谢物污染的区域的生物除污的情况下，这是非常显著的）；抗生素来自 以下组：大环内酯类（红霉素）、氨基糖苷类（链霉素）、氟喹诺酮类（环丙沙星）、四环素 类（四环素 ）、β -内酰胺类（青霉素）、糖肽类（万古霉素）。
[0018] 本发明的目的是通过使用微生物生物除污混合物（菌苗）去除毒性芳香族硝基化 合物用于生物除污被芳香族硝基化合物污染的土壤的有效方法。
[0019] 本发明的目标是包含以下的菌株的组合物：寡养单胞菌属种菌株2L、寡养单胞菌 属种菌株5L、寡养单胞菌属种菌株6L、寡养单胞菌属种菌株3Ν、无色杆菌属种菌株4Ρ、 节杆菌属种菌株1Ν、短波单胞菌属种菌株2Ν、短波单胞菌属种菌株5Ν、短波单胞菌属 种菌株6Ν、假单胞菌属种菌株3G、和假单胞菌属种菌株4G，其以编号KKP 2041ρ保藏。 (IAFB工业微生物保藏中心-波兰农业及食品生物科技研究所，波兰）。
[0020] 优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对来自以下组的 抗生素的抗性：氨基糖苷类、氟喹诺酮类、糖肽类、大环内酯类、青霉素类、磺胺类、四环素 类。
[0021] 优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对环丙沙星的抗 性。
[0022] 优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对红霉素的抗 性。
[0023] 优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对庆大霉素的抗 性。
[0024] 优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对青霉素的抗 性。
[0025] 优选的是，所述组合物中的至少一种菌株，更优选所有菌株，显示对链霉素的抗 性。
[0026] 优