一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法
【专利摘要】本发明公开了一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤：步骤一：配制罗汉果组织培养所需要的MS去菌培养基；步骤二：将受细菌污染的罗汉果组培丛生芽接种到MS去菌培养基中，经过去菌培养，得到无菌的组培丛生芽；步骤三：配制罗汉果组织培养所需要的MS复壮培养基；步骤四：将获得的无菌的组培丛生芽接种到MS复壮培养基中，经过复壮培养，得到健康组培苗，MS去菌培养基中还添加有抗生素、无光触媒和溶菌酶，经过去菌培养能在短时间内根除细菌污染对丛生苗的影响。本发明能为种质保存及工厂化生产提供健康种源保证。
【专利说明】一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织培养领域，尤其涉及一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法。
【背景技术】
[0002]罗汉果是卫生部首批公布的药食两用名贵中药材，果实营养价值很高，含丰富的维生素C以及糖甙、果糖、葡萄糖、蛋白质、脂类等，罗汉果甜苷是一种低热量高甜度的天然甜味剂，其甜度堪称世界之最，且低热、无毒，可为糖尿病和肥胖病患者等食用。罗汉果甘、酸、性凉，具有清热凉血、生津止咳、滑肠排毒、嫩肤益颜、润肺化痰等功效，是广西著名的道地药材。广西罗汉果产量占世界的90%以上，成为桂北重要的特色产业，已获国家地理标志产品保护。近年来，我国越来越多的企业加入到生产罗汉果的行列，罗汉果组培苗市场需求量增大，组织培养是罗汉果产业化发展的重要手段，现已实现了工业化生产。
[0003]MS培养基是多数植物组织培养快速繁殖的基本培养基。现有技术中的MS组织培养基通常其配方如下:大量元素:硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、氯化钙440mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L ;微量元素:硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硼酸6.3mg/L、硫酸铜 0.025mg/L、碘化钾 0.83mg/L、氯化钴 0.025mg/L、钥酸钠 0.25mg/L ;铁盐:硫酸亚铁27.8mg/L、乙二铵四乙酸钠37.3mg/L ;有机成分:盐酸硫胺素0.lmg/L、甘氨酸2.0mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 0.5mg/L、盐酸批P多醇 0.5mg/L、鹿糖 30000mg/L、琼脂 7000mg/L0
[0004]MS培养基能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围很广，是多数植物组织培养快速繁殖的基本培养基。在继代和生根培养过程中采用基本的MS培养基育种过程中会遇到大量的细菌污染并产生恶性循环，严重时培养基表面出现白色或黄色水渗样物质，使污染的组培苗生长缓慢，既不增殖也不生根，甚至死亡，试验材料无法得到保存，并给后续试验及种苗推广带来巨大的损失。
[0005]抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物，在低浓度下就能抑制细菌细胞壁的合成、干扰蛋白质的合成以及抑制核酸的转录和复制，对细菌有很好的抑制和杀灭作用。
[0006]无光触媒主要成分是超纳米微分子磷酸二氧化钛化合物，不仅在无光状态而且在任何条件下均可产生强烈催化降解功效，能有效杀灭多种细菌，抗菌率高达99.99%，并能将细菌或真菌释放出的毒素分解及无害化处理。
[0007]细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，溶菌酶是一种能水解细菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的糖苷键，使细菌细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，且溶菌酶与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，对溶菌酶有增效作用。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法。在罗汉果的去菌培养基中加入抗生素、无光触媒、溶菌酶来去除罗汉果组织培养中的细菌污染，在短时间内能根除细菌污染对丛生苗的影响，为种质保存及工厂化生产提供种源保证。复壮培养基中加入活性炭，利用活性炭的强吸附作用，可吸附残留的抗生素及其它激素，以缓解抗生素的使用对丛生芽的影响，还给培养物的生根和生长营造了近似自然生长条件下的黑暗环境，使丛生芽茎段长高、茎杆粗壮，叶片展开，叶色浓绿。
[0009]本发明提供的技术方案为:
[0010]一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤:
[0011]步骤一:配制罗汉果组织培养所需要的MS去菌培养基；
[0012]步骤二:将受细菌污染的罗汉果组培丛生芽接种到MS去菌培养基中，经过去菌培养，得到无菌的组培丛生芽；
[0013]步骤三:配制罗汉果组织培养所需要的MS复壮培养基；
[0014]步骤四:将获得的无菌的组培丛生芽接种到MS复壮培养基中，经过复壮培养，得到健康组培苗；
[0015]所述MS去菌培养基中还添加有无光触媒和溶菌酶，MS复壮培养基中添加有活性炭。
[0016]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述MS去菌培养基为基本的MS培养基中加入0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、20_120mg/L的卡那霉素、2_20mg/L的头孢噻肟钠和5-50mg/L的链霉素、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
[0017]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述MS去菌培养基为基本的MS培养基中加入0.5mg/L的6-节基氨基嘌呤、90mg/L的卡那霉素、10mg/L的头孢噻肟钠和25mg/L的链霉素、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
[0018]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述MS去菌培养基中还添加有质量分数为0.01-0.05%的植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸中的任意一种或几种。
[0019]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述MS复壮培养基为基本的MS培养基中加入0.05mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.0 lmg/L的萘乙酸、0.0 lmg/L的吲哚丁酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
[0020]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述去菌培养和复壮培养中，培养室的温度为24-27°C，光照强度为20001UX，光照时间为10-12小时/天，培养时间为30天。
[0021]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述无光触媒和溶菌酶是在所述琼脂加入前添加。
[0022]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述活性炭的浓度为 1.0g/L。
[0023]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述无光触媒的质量分数为0.5-1.0%。
[0024]优选的是，所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述溶菌酶的质量分数为 0.03-0.07%。
[0025]本发明提供了一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法。在罗汉果的去菌培养基中加入抗生素、无光触媒、溶菌酶来去除罗汉果组织培养中的细菌污染，在短时间内能根除细菌污染对丛生苗的影响，为种质保存及工厂化生产提供种源保证。复壮培养基中加入活性炭，利用活性炭的强吸附作用，可吸附残留的抗生素及其它激素，以缓解抗生素的使用对丛生芽的影响，还给培养物的生根和生长营造了近似自然生长条件下的黑暗环境，使丛生芽茎段长高、茎杆粗壮，叶片展开，叶色浓绿。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0027]实施例1:
[0028]一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤:
[0029]步骤一:配制罗汉果组织培养所需要的MS去菌培养基，所述MS去菌培养基为基本的MS培养基中加入0.5mg/L的6-节基氨基嘌呤、20mg/L的卡那霉素、2mg/L的头孢噻厢钠和5mg/L的链霉素、0.05%的聚合磷酸盐、0.5%的无光触媒、0.03 %的溶菌酶、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8，去菌培养室的温度为24°C，光照强度为20001ux，光照时间为10小时/天，培养时间为30天；
[0030]所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述无光触媒和溶菌酶是在所述琼脂加入前添加。
[0031]步骤二:将受细菌污染的罗汉果组培丛生芽接种到MS去菌培养基中，经过去菌培养，得到无菌的组培丛生芽；
[0032]步骤三:配制罗汉果组织培养所需要的MS复壮培养基，所述MS复壮培养基为基本的MS培养基中加入0.05mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.0 lmg/L的萘乙酸、0.0 lmg/L的吲哚丁酸、1.0g/L的活性炭、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8，复壮培养室的温度为24°C，光照强度为20001UX，光照时间为10小时/天，培养时间为30天；
[0033]步骤四:将获得的无菌的组培丛生芽接种到MS复壮培养基中，经过复壮培养，得到健康组培苗。
[0034]实施例2:
[0035]一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤:
[0036]步骤一:配制罗汉果组织培养所需要的MS去菌培养基，所述MS去菌培养基为基本的MS培养基中加入0.5mg/L的6-节基氨基嘌呤、120mg/L的卡那霉素、20mg/L的头孢噻月亏钠和50mg/L的链霉素、0.01%的植酸、1.0 %的无光触媒、0.07%的溶菌酶、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8，去菌培养室的温度为27°C，光照强度为20001ux，光照时间为12小时/天，培养时间为30天；
[0037]所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述无光触媒和溶菌酶是在所述琼脂加入前添加。
[0038]步骤二:将受细菌污染的罗汉果组培丛生芽接种到MS去菌培养基中，经过去菌培养，得到无菌的组培丛生芽；
[0039]步骤三:配制罗汉果组织培养所需要的MS复壮培养基，所述MS复壮培养基为基本的MS培养基中加入0.05mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.0 lmg/L的萘乙酸、0.0 lmg/L的吲哚丁酸、1.0g/L的活性炭、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8，复壮培养室的温度为27°C，光照强度为20001UX，光照时间为12小时/天，培养时间为30天；
[0040]步骤四:将获得的无菌的组培丛生芽接种到MS复壮培养基中，经过复壮培养，得到健康组培苗。
[0041]实施例3:
[0042]一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤:
[0043]步骤一:配制罗汉果组织培养所需要的MS去菌培养基，所述MS去菌培养基为基本的MS培养基中加入0.5mg/L的6-节基氨基嘌呤、70mg/L的卡那霉素、llmg/L的头孢噻月亏钠和27mg/L的链霉素、0.03%的甘氨酸、0.75%的无光触媒、0.05 %的溶菌酶、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8，去菌培养室的温度为25°C，光照强度为20001ux，光照时间为11小时/天，培养时间为30天；
[0044]所述的消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法中，所述无光触媒和溶菌酶是在所述琼脂加入前添加。
[0045]步骤二:将受细菌污染的罗汉果组培丛生芽接种到MS去菌培养基中，经过去菌培养，得到无菌的组培丛生芽；
[0046]步骤三:配制罗汉果组织培养所需要的MS复壮培养基，所述MS复壮培养基为基本的MS培养基中加入0.05mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.0 lmg/L的萘乙酸、0.0 lmg/L的吲哚丁酸、1.0g/L的活性炭、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8，复壮培养室的温度为25°C，光照强度为20001UX，光照时间为11小时/天，培养时间为30天；
[0047]步骤四:将获得的无菌的组培丛生芽接种到MS复壮培养基中，经过复壮培养，得到健康组培苗。
[0048]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
【权利要求】
1.一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，包括以下步骤: 步骤一:配制罗汉果组织培养所需要的MS去菌培养基； 步骤二:将受细菌污染的罗汉果组培丛生芽接种到MS去菌培养基中，经过去菌培养，得到无菌的组培丛生芽； 步骤三:配制罗汉果组织培养所需要的MS复壮培养基； 步骤四:将获得的无菌的组培丛生芽接种到MS复壮培养基中，经过复壮培养，得到健康组培苗； 其特征在于，所述MS去菌培养基中还添加有无光触媒和溶菌酶，MS复壮培养基中添加有活性炭。
2.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述MS去菌培养基为基本的MS培养基中加入0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、20_120mg/L的卡那霉素、2-20mg/L的头孢噻肟钠和5-50mg/L的链霉素、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
3.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述MS去菌培养基为基本的MS培养基中加入0.5mg/L的6-苄基氨基嘌呤、90mg/L的卡那霉素、10mg/L的头孢噻肟钠和25mg/L的链霉素、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
4.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述MS去菌培养基中还添加有质量分数为0.01-0.05%的植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸中的任意一种或几种。
5.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述MS复壮培养基为基本的MS培养基中加入0.05mg/L的6-苄基氨基嘌呤、0.01mg/L的萘乙酸、0.01mg/L的吲哚丁酸、30g/L的蔗糖和4.5g/L的琼脂，其pH值为5.8。
6.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述去菌培养和复壮培养中，培养室的温度为24-27°C，光照强度为20001uX，光照时间为10-12小时/天，培养时间为30天。
7.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述无光触媒和溶菌酶是在所述琼脂加入前添加。
8.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述活性炭的浓度为1.0g/L。
9.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述无光触媒的质量分数为0.5-1.0 %。
10.如权利要求1所述的一种消除罗汉果组织培养中细菌污染的方法，其特征在于，所述溶菌酶的质量分数为0.03-0.07%。
【文档编号】A01H4/00GK104396735SQ201410488635
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】潘丽梅, 马小军, 白隆华, 莫长明, 曾雯雯, 姚绍嫦, 韦荣昌 申请人:广西壮族自治区药用植物园