专利名称：兼具脱氮除磷功能的木糖氧化无色杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株木糖氧化无色杆菌(AchromcAacter xylosoxidans)及其在废水处理中的应用。该菌株具有异养硝化-好氧反硝化的功能，可以在同步硝化反硝化脱氮的过程中，同时完成污水中含磷污染物的去除，从而达到生活污水同步生物脱氮除磷的目的。
背景技术：
随着社会的进步和经济的发展，我国各类水体富营养化污染日益严重，蓝藻赤潮问题频发，对水体安全和人体健康造成了巨大的损害。氮、磷等营养物质过剩是引发水体富营养化的根本原因，当水体中N浓度> 0. aiig/l，P浓度> 0. 02mg/l时就会发生富营养化现象。生活污水是氮、磷等营养物质的最大排放源；为此，我国一直致力于开发各种各样的生活污水脱氮除磷工艺以从根本上防止富营养化问题的发生。生物脱氮技术是目前应用最广的污水脱氮技术，基本原理是在微生物的作用下将污水中的有机氮和氨态氮转化为队的过程。其中包括硝化和反硝化两个反应过程。硝化反应是由一群自养好氧微生物完成的，它分为两个阶段，分别由亚硝酸菌和硝酸菌两种菌完成。第一步是由亚硝酸菌将NH4+氧化为NO”第二步是由硝酸菌将NO2-进一步氧化为N03_。 反硝化反应是由一群异养型兼性厌氧微生物完成的，是指在无氧或低氧条件下，反硝化细菌将NO2-和NO3-还原为氮气的过程。由上述基本原理可以看出，生物脱氮过程本身就存在着矛盾硝化反应需要较长的污泥龄和好氧条件，大量有机物存在时会造成硝化细菌的流失；而反硝化细菌则需要较短的污泥龄和缺氧条件，高度依赖有机物为其脱氮过程提供电子供体。因硝化细菌和反硝化细菌生理机制的差异导致了基于该理论的污水脱氮技术工艺冗长，能耗大，占地面积大，且对环境变化非常敏感，脱氮效率不佳。污水除磷的方法有化学除磷、生物除磷以及生化除磷等。化学除磷的基本原理是通过投加化学药剂形成不溶性磷酸盐沉淀物，最终通过固液分离的方法将磷从污水中去除，有石灰沉淀法及金属盐沉淀法。化学除磷操作简单、除磷效果好、抗冲击负荷能力强； 但是需要投加大量的化学药剂，处理费用较高，并且会产生二次污染。生物除磷工艺是目前较为经济的除磷方法，其基本原理是聚磷菌(Poly-phosphate-Accumulatuing Organisms, PAOs)的吸/释磷过程在厌氧条件下，PAOs分解细胞聚磷酸盐的同时产生ATP，并利用ATP 将环境中的挥发性脂肪酸等小分子有机物摄入胞内，将其以PHB(聚-β羟基丁酸盐)及糖原等有机颗粒的形式存在于细胞内，同时将聚磷酸盐水解生成的正磷酸盐(Po/—)排出细胞外；在好氧条件下，PAOs以氧气为电子受体，利用PHB代谢释放的能量，从污水中吸收超过其生长所需要的磷并以聚磷酸盐的形式贮存在细胞体内。通过排泥的方式将被细菌过量摄取的磷随剩余污泥排出系统即可实现除磷的目的。生物脱氮除磷发生机制的差异导致了这两个过程本身就是一个矛盾统一体，产生矛盾的根本原因是不同功能的微生物所需要的最佳生长条件不同。硝化需要长泥龄的硝化细菌和好氧条件，反硝化需要短泥龄的反硝化菌和缺氧条件，释磷需要短泥龄的聚磷菌和厌氧条件，而吸磷则需要好氧条件。此外，反硝化菌和聚磷菌之间还存在着因生活污水中碳
3源不足而产生的竞争关系。生物脱氮除磷工艺的发展也主要是围绕着在同一污水处理系统中实现脱氮与除磷的矛盾展开的。因这些固有矛盾的存在，造成了我国多数污水处理厂运行费用高、脱氮除磷效果不稳定、达标率较低，开发节能高效的城镇污水处理工艺已迫在眉睫。近年来，生物脱氮除磷在技术与理论方面也有了新的进展和突破。在生物脱氮技术上，开发出了 SHARON、CANON、OLAND和ΑΝΝΑΜ0Χ等新型脱氮工艺，这些工艺在某种程度上解决了脱氮过程对碳源的依赖，但仍未摆脱好氧厌氧结合的两段式生物脱氮的限制。异氧硝化-好氧反硝化菌能够在单一好氧条件下完成污水中氮的去除，因此成为了近年来生物脱氮领域的研究热点，经过众多研究者的努力，不断开发出具有异氧硝化-好氧反硝化功會邑的微生物，如Pseudomonas Spp、Alcaligenes faecalis、Agrobacterium sp禾口Comamonas sp.。在生物除磷理论上，发现了特殊的反硝化聚磷菌(DPB)，其基本原理为在厌氧阶段，DPB 充分利用环境中的挥发性脂肪酸等小分子有机物进行大量繁殖，同时水解细胞内的聚磷酸盐将产生的无机磷酸盐排出细胞外，并利用此过程产生的ATP合成PHB贮存体内；在缺氧阶段，DPB以硝酸盐氮作为氧化PHB的电子受体，降解PHB所产生的能量一部分用于维持生命活动，一部分则用于过量摄取水中无机磷酸盐并以聚合磷酸盐的形式储存于细胞体内，同时将硝酸盐氮还原为氮气。相比传统除磷理论，反硝化除磷过程能够节省一定的COD与曝气量，进而减少了污泥产量。然而，无论是PAOs理论还是DPB理论，都需要好氧/缺氧/厌氧交替的环境来提供微生物的生长条件。本申请的发明人分离出一株木糖氧化无色杆菌(AchromcAacter xylosoxidans, ZL200910085187. 9)，发现其具有异养硝化-好氧反硝化的能力；发明人进一步发现这种细菌在单一好氧条件下兼有除磷的能力。利用这类具有特殊性质的细菌的生理特性和代谢机理，基于硝化过程可以是异养细菌的生理行为，而反硝化和除磷过程可以在好氧条件下进行，使得可以在同一好氧环境下完成脱氮除磷，能够较好的克服上述提到的传统工艺中存在的矛盾问题，由此完成了本发明。无论是异氧硝化-好氧反硝化生物脱氮理论还是PAOs/ DPB生物除磷理论，都是建立在单一的脱氮或除磷功能研究基础之上，至今没有研究表明一种微生物同时具有异氧硝化-好氧反硝化脱氮和除磷的功能。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种具有异养硝化-好氧反硝化和好氧摄磷能力的菌株及其在废水处理中的应用。本发明提供的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)菌株已于2009 年3月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为 CGMCC Na 2964。本发明所提供的菌株，具有以下表型特征在33-40°C下，营养琼脂培养基上培养 16-32h后，菌落表面光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(0. 5 1. 2) μ mX (0· 5 2· 6) μ m，细胞单个出现。本发明所提供的菌株，具有以下生理生化特征接触酶、氧化酶、尿素酶反应结果为阳性；不能够进行纤维素水解反应；MR和VP结果呈阴性；能够以柠檬酸钠为碳源进行生长；不能利用葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖发酵。
该菌株的16S rRNA基因序列特征其16S rRNA具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列，序列长度为1473bp。根据其形态特征和生理生化特征及其16S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)。本发明所提供的木糖氧化无色杆菌(AchromcAacter xylosoxidans)能够以有机物为电子受体，NH4+为电子供体，将NH4+氧化为NO2-或NO3-；能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，N02_或N03_为电子受体，将其还原为氮气；还能够在好氧条件下，将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。本发明所提供的木糖氧化无色杆菌(AchromcAacter xylosoxidans)可用于同步脱氮除磷，在实际应用中，可将菌株置于废水中实现氮磷同步去除的目的。所述废水的碳氮比可为4-12，优选为8-12.所述废水的温度可为20_40°C，优选为20_30°C。所述废水的pH可为6. 5-9. 5，优选为7-8。本发明的木糖氧化无色杆菌及其应用与现有技术相比较有如下有益效果(1)根据兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能细菌的生理特征和代谢机理，实现了好氧条件下氮磷的同步去除，解决了传统废水处理中生物脱氮除磷需要采取厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段处理的瓶颈问题；(2)硝化和反硝化偶联进行，反硝化过程中产生的碱度可以很好的弥补硝化过程中产生的酸度，整个过程无需加碱调节PH ；相比自养硝化细菌，异养硝化细菌的生长速率快、细胞产率高，可以有效解决自养硝化细菌增值缓慢、系统水力停留时间长的问题；(3)脱氮和除磷同步进行，解决了反硝化菌和聚磷菌对碳源的竞争问题；(4)采用本发明，在传统活性污泥法的二级生化处理系统，可以完成碳氮磷的同步去除，无须构建新的反应器，最大限度的简化了工艺流程，节省了设备和投资的成本，因此， 具有较好的经济效益和环保效益；(5)本发明适用于各种废水的脱氮除磷处理，应用前景广阔，具有很好的社会效
■、Λ
frff. ο下面结合具体实施方式
对本发明进行详细描述。本领域的普通技术人员可以理解，实施例仅仅是举例说明的目的，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。
附图1木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)对磷酸盐的降解曲线附图2木糖氧化无色杆菌(AchromcAacterxylosoxidans)对氮素和磷酸盐的降解曲线附图3木糖氧化无色杆菌(AchromcAacterxylosoxidans)长期培养时对氮素的降解曲线附图4木糖氧化无色杆菌(AchromcAacterxylosoxidans)长期培养时对磷酸盐的降解曲线
具体实施例方式
实施例中各种污染物的监测分析方法参考《水和废水监测分析方法》(第四版，中国环境科学出版社，200 。温度和溶解氧通过便携式溶氧测定仪(YSI550A，USA)进行测定。污泥浓度(MLSQ和挥发性悬浮固体浓度(MLVSQ根据重量法测定。
实施例中使用的各种单位，统一采用国家标准。实施实例1 木糖氧化无色杆菌AchromcAacter xylosoxidans在好氧条件下的除磷能力测定将木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)菌株(于2009年3月 19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为 CGMCC No四64，下同)接种于IL的LB培养基中，防止杂菌的侵入并保持菌体的生长活力， 进行富集培养。将培养得到的菌液离心，用无菌水洗涤三次，制成光密度(0D_)为1-2的菌悬液。取5mL上述菌悬液加入两个含有120mL测试培养基(每L含5g 丁二酸钠， 0. 191 IgNH4Cl，0. 044g KH2PO4,0. 2g CaCl2 · 2Η20，0· 5g MgSO4 · 7Η20，0· 006g FeSO4 · 7H20, pH7. O 7. 5)的锥形瓶中，用9层纱布封口，30°C 150rpm的摇床中振荡培养。未接种菌悬液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。于^!、iai、24h和3 取少量反应液，其中一部分直接用于测定菌体光密度，其余部分在SOOOrpm下离心5min，取上清液测定磷酸根的浓度。实验结果见附图1。由图可见，菌株木糖氧化无色杆菌(AchromcAacter xylosoxidans)在接种后菌体数量呈直线上升趋势；并且随着菌体数量的增长，磷酸盐的浓度也在快速下降，在12h时去除率最大，达到100%。由此说明，在单一好氧条件下，本发明的木糖氧化无色杆菌(AchromcAacter xylosoxidans)菌株可较好地完成对磷酸盐的高效去除。实施实例2 木糖氧化无色杆菌AchromcAacter xylosoxidans最佳除磷条件的确定采用摇瓶实验的模式，依据正交实验原理，以pH值、摇床培养温度、摇床转速和碳氮比四个因素为影响因子，建立了 4因素3水平共计9次正交试验以确定菌株木糖氧化无色杆菌AchromcAacter xylosoxidans的最佳除磷条件。实验中选用的培养基除去丁二酸钠含量根据需要改变外，其余组分和浓度一律与实施例1相同。正交实验设计及结果见表1所示。表1正交实验设计及结果
权利要求
1.兼具异养硝化-好氧反硝化和除磷功能的菌株在废水处理中的应用，其特征是选用木糖氧化无色杆菌AchromcAacter xylosoxidans对废水进行处理，实现同步脱氮和除磷的目标。
2.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌AchromcAacterxylosoxidans，其特征在于 该木糖氧化无色杆菌菌株的16S rRNA基因具有如序列表SEQ ID 1所示的核苷酸序列，序列长度为147;3bp，其保藏号为CGMCC No.四64。
3.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌AchromcAacterxylosoxidans，其特征在于 在33-40°C下，营养琼脂培养基上培养16-3 后，菌落表面光滑，无色素；通过革兰氏染色后在显微镜下呈阴性，菌体呈杆状，大小为(0. 5 1. 2) μ mX (0. 5 2. 6) μ m，细胞单个出现。
4.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌AchromcAacterxylosoxidans，其特征在于 能够以有机物为电子受体，NH4+为电子供体，将NH4+氧化为NO2-或NO3-；能够在好氧的条件下，以有机物为电子供体，N02_或N03_为电子受体，将其还原为氮气；还能够在好氧条件下， 将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。
5.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌AchromcAacterxylosoxidans的应用，其特征在于其所述的废水的碳氮比范围为4-12，优选为8-12。
6.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌AchromcAacterxylosoxidans的应用，其特征在于其所述的废水的温度范围为20-40°C，优选为20-30°C。
7.权利要求1所述的木糖氧化无色杆菌AchromcAacterxylosoxidans的应用，其特征在于其所述的废水的PH范围为6. 5-9. 5，优选为7-8。
8.权利要求1所述的应用，其特征是利用木糖氧化无色杆菌AchromcAacter xylosoxidans或以其为活性成份微生物制剂对废水进行处理，可在同一好氧环境下完成硝化、反硝化和除磷过程，进而实现氨氮、总氮及磷的同时去除。
全文摘要
本发明涉及一株兼具异养硝化-好氧反硝化与除磷功能的木糖氧化无色杆菌Achromobacter xylosoxidans在废水处理中的应用。该菌株可以利用有机碳为唯一碳源，氨氮为唯一氮源进行新陈代谢，通过异养硝化-好氧反硝化作用把氨氮直接转为气体产物，达到脱氮的目的；该菌株也能以硝酸盐氮为唯一氮源，通过好氧反硝化作用将硝酸盐氮转化为气体产物；还能在好氧条件下将无机磷摄入体内转化为自身组分进而实现去除污水中磷元素的目的。将该菌株应用于废水的处理，可实现单一好氧条件下氮磷的同步去除，较好解决了传统废水处理中生物脱氮除磷需要采取厌氧释磷、缺氧反硝化、好氧硝化吸磷分段处理的难题，具有广阔的应用前景。
文档编号C02F3/02GK102533623SQ201210056630
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者倪晋仁, 邹仕强, 陈倩 申请人:北京大学