一株非解乳糖链球菌菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物菌种选育技术领域，具体涉及一株自鸡盲肠分离筛选出的非解 乳糖链球菌菌株。
【背景技术】
[0002] 随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展，许多新型复杂的技术被应用于菌种 选育，如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术等，但是诱变育种技术仍是提供菌株 生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高，可以得到多种优良突变体和新的 有益基因类型。另一方面，诱变育种存在一定的盲目性和随机性，在实际应用中，研宄者 应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法。陈凤莲等[2009年，哈 尔滨商业大学学报]通过采用紫外线诱变的方法结合平板培养基得到一产木聚糖酶活力 高的黑曲霉菌株A3,活力可达到58. 305U/mL。徐同宝等（2009年）以黑曲霉XE6为出发菌 株，经微波和硫酸二乙酯诱变处理，选育出一株高产木聚糖酶菌株mAnl，该菌株遗传性状 稳定，并且利用单因素轮换法和正交试验法对菌株进行发酵研宄，发现木聚糖酶的酶活为 81. 151U/g，比出发菌株的酶活提高了 34.88%。
【发明内容】
[0003] 为了进一步选育生产发酵黄芪多糖性能更好的菌株，本申请将紫外线和亚硝基胍 结合起来，对非解乳糖链球菌CGMCC No. 4227进行复合诱变，得到了一种发酵生产黄芪多 糖更为理想的菌株一非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus) UN10-1菌株，并将 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏时间2014年04月08日，保藏号CGMCC No. 9022。
[0004] 本发明的第二个目的是提供一种包含非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus)UN10_l CGMCC No. 9022的发酵菌剂，其特征在于：所述发酵菌剂由以下步 骤制备得到：
[0005] (1)将非解乳糖链球菌（Streptococcus alactolyticus) UN10-1 CGMCC No. 9022 接入MRS培养基进行斜面培养；接种量为培养基体积分数的2% ;
[0006] (2)将步骤（1)得到的培养物进行发酵培养，得到发酵菌剂，接种量为培养基体积 分数的3%。
[0007] 优选地，所述步骤（1)的培养条件为：温度37°C，厌氧培养，时间为24h，pH值 6. 4 ~7. 4〇
[0008] 优选地，所述步骤（2)的培养条件为：温度37°C，厌氧培养，转速120r/min，时间 48小时，pH值6. 4~7. 4。
[0009] 本发明的第三个目的是提供上述非解乳糖链球菌UN10-1的筛选方法，是先进行 紫外线诱变再进行亚硝基胍诱变得到的。
[0010] 优选地，所述紫外线诱变的条件为：波长为254nm，功率为15W，时间为IOs ;所述亚 硝基胍诱变的条件为I. 〇mg/ml。 toon] 本发明的第四个目的是提供上述菌株在提取多糖中的应用。
[0012] 本发明的第五个目的是提供上述菌株在发酵黄芪中的应用。
[0013] 本发明采用紫外线（UV)诱变和亚硝基胍（NTG)诱变相结合的复合诱变方法 (UV-NTG)对非解乳糖链球菌CGMCC No. 4227对数期菌悬液进行诱变筛选，最终获得了一株 遗传稳定性好、安全的非解乳糖链球菌UN10-1CGMCC No. 9022。利用其发酵黄芪后，多糖产 量为293. 39mg/g，较原始出发菌株提高了 94. 99%，具有良好的开发前景。
[0014] 本发明的菌株具有发酵黄芪性能好，多糖产量高，安全性高等特点，可用于生产发 酵型黄芪多糖。
【附图说明】
[0015] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0016] 图1为不同的UV+NTG诱变条件与非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株CGMCC No. 4227 致死率的关系图；
[0017] 图2为UV-NTG复合诱变对非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株CGMCC No. 4227诱变后 多糖产量的影响图。
【具体实施方式】
[0018] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0019] 实施例1
[0020] 1.菌种的复苏与活化
[0021] 将中国专利201210141827. 5中提供的非解乳糖链球菌LZMYFGM9菌株（该菌株的 分类命名为非解乳糖链球菌Streptococcus alactolyticus，保藏编号为CGMCC No. 4227， 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所；保藏时间2010年10月19日）在37°C 快速复苏，然后在无菌操作台内将解冻的菌株接入灭菌MRS肉汤培养基中，在37°C厌氧条 件下培养18_24h。按2%接种量将种子液加至新的灭菌MRS肉汤培养基中，将复苏好的菌 进行传代培养。
[0022] 取出已经活化并传4代培养至对数期的培养液，3500r/min离心15min，弃上清，加 等体积无菌PBS(100mmol/L，pH7)，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤2次，用 PBS恢复成菌悬液，菌悬液浓度控制为IO6个/ml左右，将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的 无菌三角瓶内，振荡20-30min，打散细胞。
[0023] 2.诱变处理
[0024] 申请人共设计了三种不同的诱变处理方法，具体如下：
[0025] (1)紫外线（UV)诱变
[0026] 波长为254nm，功率为15W的紫外灯预热30min后，取6. OmL菌悬液分别铺于7个 直径为9cm的无菌培养皿中，将盛有菌悬液的平皿放在磁力搅拌器上，距离紫外灯20cm，分 别照射〇8、1〇8、3〇8、6〇8、9〇8、12〇 8、15〇8，边照射边搅拌，使菌体均匀接受紫外线光波。在红 光下取0.1 mL菌悬液，用无菌生理盐水梯度稀释后涂布灭菌MRS琼脂培养基平板，每个稀 释度涂布3个平板，37°C厌氧避光培养，72h后观察统计菌落总数，以未经紫外线处理的稀 释液涂布平板为对照，计算致死率。
[0027] (2)亚硝基胍（NTG)诱变
[0028] 准确称取20mg亚硝基胍于棕色瓶中，加0. 2ml丙酮使其溶解，溶解后加 PBS溶 液l〇ml，配制成2. Omg/ml亚硝基胍（NTG)母液。将NTG母液与菌悬液按比例混合，使NTG 的最终浓度分别为 〇· 5mg/mL、l. Omg/mL、l. 5mg/mL、2. 0mg/mL，30°C水浴，分别处理 IOmiru 20min、30min、60min，将NTG处理过的菌体3500r/min离心15min，用PBS冲洗3次以除去 NTG残留，用PBS将菌悬