珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物动物细胞系领域，具体涉及珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法、应用。
【背景技术】
[0002]珍珠龙胆石斑鱼是由鞍带石斑鱼(EpiMphelus Ianceolatus ? )(俗称龙胆石斑鱼)与棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus )(俗称老虎斑)杂交的新品种，有着老虎斑的头，龙胆石斑鱼的尾巴，显现杂交优势，其肉质细嫩，抗病力强，生长快，已成为我国南方海水养殖业的新宠。近年来，随着养殖石斑鱼规模的不断扩大，集约化程度的不断提高，以及受养殖环境污染、管理技术措施相对滞后等诸多因素的影响，石斑鱼的病害也日益严重。石斑鱼疾病繁多，病原包括病毒、细菌、寄生虫等，尤其是由虹彩病毒、神经坏死病毒引起的病毒病最为严重，一旦暴发就会造成大规模死亡甚至全军覆没，每年因其造成的直接经济损失亿元以上，已经成为石斑鱼养殖业健康发展的重要制约因素之一。
[0003]细胞系作为一种体外培养系统，具有成本低、可重复性好、条件可控等优点。建立细胞系，不断增加和完善我国重要海水养殖动物细胞库，是长期保存重要海水养殖动物遗传资源的重要途径。同时，细胞系又是海水养殖动物细胞工程育种、动物克隆和物种保护、病毒分离与培养、研宄病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等方面的重要工具。
[0004]尽管已经有多种鱼类及其不同组织建立细胞系的技术，但很多学者仍然认为建立细胞系是一项非常困难、繁琐、耗时、随机性大和成功率低的工作。不同鱼类之间的细胞系构建方法和难易程度往往不同。斑马鱼作为一种重要的脊椎动物模式生物，被广泛地应用于发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研宄。针对斑马鱼的细胞系建立虽然已经做了很多研宄，但是斑马鱼组织细胞系建立的研宄仍有许多问题没有解决。目前已报道的斑马鱼细胞系仅有两个:ZF4(ATCC CRL-2050)和ZF_L(ATCC CRL-2643)，分别来自胚胎和肝脏。而同为鲤科的草鱼的细胞系建立相对容易，目前已报道了草鱼吻端、肾、肝、尾鳍、囊胚、椎骨间质、鳔等多个组织的细胞系。同时，鱼体不同的组织有着不同的特性，在细胞培养中的难易程度各不相同，有报道表明体表和肠道组织，消毒灭菌是培养的关键；肝脏组织因含有大量的油脂而难以培养；肌肉组织因细胞迀出及生长速度慢，不太适合建立细胞系(Zhou et al’J.fish b1l.2008，73 (8): 2058-2067)。在原代培养的过程中，不同组织细胞迀出的速度有别，与鱼的种类有关，也与培养条件有关。事实上，每一株细胞系都是开展生物学等领域的研宄的潜在资源。目前还没有统一和规范的建立鱼类细胞系的方法和技术手段。
[0005]迄今为止，已有160种以上的鱼类细胞系用于病毒的分离和扩增。已建立的鱼类细胞系多数来源于淡水鱼类，相比较而言，来源于海水鱼类的细胞系的报道较少。目前，仅有I篇报道建立了珍珠龙胆石斑鱼心脏组织细胞系(Guo et al.，2013)，还没有通过相应细胞系大规模生产病毒疫苗的成功报道。显然，鱼类细胞培养是进行鱼类病毒分离、鉴定与繁殖，进而研宄鱼类病毒的致病机理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的最基础一步。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种能稳定传代的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系及其构建方法，为分离、鉴定海水鱼类病毒及病毒疫苗制备提供研宄平台和实验材料。
[0007]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0008]珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，其的生物学名称为PGSN，该细胞系于2015年01月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心，地址:中国.武汉.武汉大学，邮编:430072)，并证明存活，保藏登记入册编号为CCTCC NO:C201505。该细胞系细胞生长状态良好，细胞在温度25-32°C、含10-15%胎牛血清的L15培养基中增殖良好。细胞形态为成纤维样细胞，能稳定增殖，目前细胞已传至70代以上。染色体分析显示特征染色体数目为48条。
[0009]本发明目的之二在于提供上述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系的构建方法，其包括以下步骤:
[0010]I)吻端组织的处理:取健活珍珠龙胆石斑鱼，对鱼体进行消毒，用灭菌解剖器械取其吻端组织块，浸泡于漂洗液中；
[0011]2)原代细胞培养:将吻端组织块切成小组织块，加贴块专用培养液浸没所有小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶中进行恒温干贴后，加入完全培养液，置于恒温培养箱开始原代培养；
[0012]3)传代培养:原代培养细胞汇合度达60-90%时进行传代培养，每5-7天传代一次。
[0013]其中，步骤2)的具体步骤如下:取健活珍珠龙胆石斑鱼，用医用酒精浸泡l_5min对鱼体进行整体消毒，用75%酒精进行再次消毒，置于超净工作台中，用灭菌解剖器械取其吻端组织块，浸泡于漂洗液中。
[0014]其中，步骤2)的具体步骤如下:吻端组织块用漂洗液冲洗，使用刀片切至l_4mm3的小组织块，加贴块专用培养液，浸没所有小组织块，将上述小组织块接种于细胞培养瓶中，翻转瓶身28°C恒温干贴8-12h，再加入完全培养液，翻正瓶身以使小组织块浸入完全培养液中，置于28°C恒温培养箱开始原代培养，每4-6天更换培养液一次。
[0015]其中，步骤3)的具体步骤如下:原代培养细胞汇合度达60-90%时，加入0.25%的胰蛋白酶消化后，加入完全培养液使细胞悬浮，然后接种于两个培养瓶内，置于28°C培养箱中培养，每5-7天传代一次。
[0016]具体地，所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400 μ g/ml链霉素和800 μ g/ml制霉菌素的M199溶液。
[0017]具体地，所述的贴块专用培养液包括以下组分:基础培养液、终浓度为30%的胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHCO3、400IU/ml 青霉素及400 μ g/ml 链霉素；所述基础培养液为Leiboviz's L15培养液。
[0018]具体地，所述的完全培养液包括以下组分:基础培养液、终浓度为5-20%胎牛血清、0.046mmol/L NaCl、0.026mmol/L NaHC03、400IU/ml 青霉素及400 μ g/ml 链霉素；所述基础培养液为Leiboviz's L15培养液或MEM培养液或M199培养液。
[0019]具体地，在步骤3)中，当传代至第5-10代时，将完全培养液中的血清浓度降至15%，青霉素浓度降至100IU/ml、链霉素浓度降至100 μ g/ml ;当传代至第15-20代时，将完全培养液中的血清浓度降至8-10%。
[0020]本发明目的之三在于提供上述的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系在鱼类病毒分离、鉴定与繁殖研宄中的应用。
[0021]相比现有技术，本发明的有益效果在于:
[0022]采用本发明的技术方案，对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织进行了原代及传代培养，取得了较好的培养效果，从而建立了珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞系，该细胞系可连续传代，已连续传至72代，因此能提供大量的珍珠龙胆石斑鱼吻端组织来源细胞，且细胞增殖培养液配方简单，无需添加外源生长因子，传代细胞能维持良好的生长状态，并可对其进行冷冻保存。本发明所构建的吻端组织细胞系为海水鱼类病毒的分离培养及分子细胞水平上开展感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等提供了便利。
[0023]下面结合具体附图和实施方式对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0024]图1为珍珠龙胆石斑鱼吻端组织块迀出细胞状态图(标尺=100 μ m);
[0025]图2为珍珠龙胆石斑鱼第I代吻端组织细胞状态图(标尺=100 μ m);
[0026]图3为珍珠龙胆石斑鱼第20代吻端组织细胞状态图(标尺=100 μ m);
[0027]图4为珍珠龙胆石斑鱼第57代吻端组织细胞状态图(标尺=100 μ m);
[0028]图5为不同培养基对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞的影响；
[0029]图6为不同血清浓度对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞的影响；
[0030]图7为不同温度对珍珠龙胆石斑鱼吻端组织细胞的影响；
[0031]图8为第53代吻端组织细胞中期染色体分裂相；
[0032]图9为第53代吻端组织细胞中期染色体数目分析。
【具体实施方式】
[0033]除另有说明外，本申请中所有的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体