一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用软鳍新光唇鱼肌肉组织建立细胞系的方法，属于淡水水生生 物细胞培养和超低温冷冻保存的技术领域。
【背景技术】
[0002] 软鳍新光唇鱼 Neolissochilus benasi ((Pellegrin&Chevey, 1936))，旧称软鳍四 须舍巴，隶属于鲤形目（Cypriniformes)鲤科（Cyprinidae)祀亚科（Barbinae)新光唇鱼属 (Neolissochilus)，主要分布于红河水系。随着中国境内红河水系水电的开发，对河道内多 种珍稀土著鱼类产生了诸多不利的影响，因此，2007年由云南省环保局批准立项，云南大唐 国际李仙江流域水电开发有限公司委托中国科学院昆明动物研宄所开展了软鳍新光唇鱼 的人工增殖放流研宄，最终于2010年突破了软鳍新光唇鱼的人工繁殖技术，并于2012年将 软鳍新光唇鱼鱼苗放流回李仙江流域，基本完成了这一珍稀土著鱼类人工增殖放流的全过 程。
[0003] 软鳍新光唇鱼野外生存环境的不断恶劣，尽管已实现了软鳍新光唇鱼的人工增殖 放流，但野外种群数量仍在锐减，因此，除加强野外引种，使更多的野外种群在保育研宄基 地得以存活外，软鳍新光唇鱼野外种群的种质资源保存已刻不容缓。在种质资源保存方法 中，细胞培养和冻存应用较为广泛，已在其他动物或海水鱼类的种质资源保存过程中得到 广泛认可，但此技术在淡水鱼类尤其是云南土著珍稀鱼类种质资源保存中的应用较少，软 鳍新光唇鱼的细胞培养方面的研宄亦是一片空白。
[0004] 尽管软鳍新光唇鱼人工繁殖技术已研发成功，并有计划的放流回李仙江流域，但 由于养殖鱼类本身的局限性，塘养环境下人工繁殖易造成染色体异常，如多倍化和异倍化， 需要细胞短期培养以用于核型分析以检测人工繁殖品种的质量，保证放流个体的成活率和 繁殖率。而对于软鳍新光唇鱼这种幼体生长较慢，个体相对较小，血液量较少的鱼类而言， 传统的血液短期培养不能满足核型分析的需要，因此有必要寻找能快速获得细胞的方法， 以满足软鳍新光唇鱼细胞的短期培养用于核型分析。
[0005] 鱼类细胞培养起于20世纪60年代，发展至今已建立了 280余株细胞系，中国的鱼 类细胞培养历经30多年，只建立了 50余株细胞系，建立细胞系的物种不足中国鱼类总数的 1. 5% (中国鱼类超过3500种），由此可见，细胞系的构建速度是非常缓慢的，关注度不够、 参与的工作者较少可能是其原因之一，另外，相较于哺乳动物细胞培养，鱼类细胞培养中更 易发生污染，导致失败率上升，而现有的专利或文章中大多将这一现象归结为技术不过关， 而嫌少注重鱼体本身的质量问题，在软鳍新光唇鱼细胞培养实践中，鱼体的生活状态也直 接影响了细胞系构建的成败，因此，软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的成功构建是建立在对软鳍 新光唇鱼野生和塘养生态习性极度了解的基础上的。经文献检索，未见与本发明的相同报 道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种操作简便易行的软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法， 以满足对软鳍新光唇鱼快速核型分析、种质资源保存和理论研宄的需要。
[0007] 本发明提供了一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步 骤：
[0008] 1)软鳍新光唇鱼肌肉的获取：先用5-10mg/L高锰酸钾浸泡软鳍新光唇鱼10-20 分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后，以75%酒精再次消毒鱼体后，加入平衡盐溶液消毒 液浸泡肌肉组织；浸泡15分钟后，将肌肉组织用消毒液清洗；
[0009] 2)原代培养：将所述肌肉组织剪成组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在 22-28°C培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在22-28°C培养箱中启动原代培养，每 三天半量更换培养液，第7-10天细胞开始从组织块中迀移，20-40天长成细胞单层；
[0010] 3)传代培养：原代肌肉细胞铺满瓶底80%后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培 养液，以含〇. 2%的胰蛋白酶的胰酶消化法传代悬起细胞，首次传代按1:1传，此后按1:2进 行传代，于22-28°C培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成 基础培养液，所述软鳍新光唇鱼肌肉细胞系建立成功。
[0011] 在本发明的一些实施例中，所述消毒液为含有浓度为100-200 μ g/ml的硫酸卡那 霉素、浓度为100-200 μ g/ml的硫酸链霉素以及浓度为10-30 μ g/ml的两性霉素 B的平衡 盐溶液。优选地，硫酸卡那霉素浓度为150 μ g/ml，硫酸链霉素的浓度为150 μ g/ml，两性霉 素 B的浓度为20 μ g/ml。
[0012] 在本发明的一些实施例中，所述基础培养液为含有占总体积的10-15%的胎牛血 清的DMEM培养液。
[0013] 在本发明的一些实施例中，所述原代培养液为含有占总体积的15-20%的胎牛血 清、浓度为100-200 μ g/ml的硫酸卡那霉素、浓度为100-200 μ g/ml的硫酸链霉素以及浓度 为10-30 μ g/ml的两性霉素 B的DMEM培养液。优选地，硫酸卡那霉素浓度为150 μ g/ml，硫 酸链霉素的浓度为150 μ g/ml，两性霉素 B的浓度为20 μ g/ml。
[0014] 在本发明的一些实施例中，所述传代培养液为含有占总体积的10-15%的胎牛血 清、浓度为50-100 μ g/ml的硫酸卡那霉素、浓度为50-100 μ g/ml的硫酸链霉素以及浓度为 5-15 μ g/ml的两性霉素 B的DMEM培养液。优选地，硫酸卡那霉素浓度为100 μ g/ml，硫酸 链霉素的浓度为100 μ g/ml，两性霉素 B的浓度为10 μ g/ml。
[0015] 在本发明的一些实施例中，所述消毒液或者培养液的pH值为7. 2-7. 4。
[0016] 本发明又提供了一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法，该构建方法还可以包 括如下细胞冻存与复苏的步骤：
[0017] 1)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO,按12:1的体积比混合，现 用现配。
[0018] 2)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000-1200rpm 离心5-10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度 约为IX IO6个/ml，将Iml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒 中，-80°C过夜，然后放入液氮中长期保存；
[0019] 3)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融 化；然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量DMEM基础培养 液，1000 rpm离心5-10分钟，除上清液；用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中， 22-28 °C培养箱中培养，7天细胞即长成单层。
[0020] 本发明的各步骤中所用的百分比为体积百分比。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 1.本发明的构建方法操作简便易行，并且构建方法重复性，构建的细胞系稳定性 好。
[0023] 2.相对于用于核型分析的血液短期培养，采用本发明的构建方法获得的肌肉组织 块中刚迀移出来的细胞具有活性，且细胞量大，可用于染色体分析。
[0024] 3.本发明的构建方法所获得的肌肉细胞系原代培养耗时短，且不需要生长因子。
[0025] 4.本发明构建的软鳍新光唇鱼肌肉细胞系形态为成纤维样，能够连续传代，迄今 已传代40代，因此能够提供大量的软鳍新光唇鱼肌肉细胞。此外，本发明构建的软鳍新光 唇鱼肌肉细胞系能够直接应用于生物学特性研宄，满足了对软鳍新光唇鱼种质资源保存和 理论研宄及应用的需要。
[0026] 5.本发明的构建方法也适用于其他鱼类构建肌肉的细胞系。
【附图说明】
[0027] 图1是示出不同培养基液对软鳍新光唇鱼肌肉细胞生长的影响的图。
【具体实施方式】
[0028] 从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。
[0029] 实施例1
[0030] 1.制备消毒液和细胞培养液
[0031] 消毒液：向平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素浓度为l〇〇μg/ml，硫酸链 霉素的浓度为100 μ g/ml，两性霉素 B的浓度为10 μ g/ml。
[0032] 基础培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的10%。
[0033] 原代培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的 15%，使硫酸卡那霉素浓度为100 μ g/ml，硫酸链霉素的浓度为100 μ g/ml，两性霉素 B的浓 度为 10 μ g/ml。
[0034] 传代培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的 10 %，使硫酸卡那霉素浓度为50 μ g/ml，硫酸链霉素的浓度为50 μ g/ml，两性霉素 B的浓度 为 5 μ g/ml〇
[0035] 调节上述培养液的pH值为7. 2,放置于4°C冰箱中保存备用。
[0036] 2.原代培养
[0037] 先用5mg/L高锰酸钾浸泡软鳍新光唇鱼20分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后， 以75%酒精再次消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板 中，加入平衡盐溶液消毒液浸泡肌肉组织。浸泡15分钟后，将肌肉组织用平衡盐溶液消毒 液清洗5次，剪成组织小块，并将其接种于25cm 2细胞培养瓶中，在22°C培养箱中倒置过夜， 次日再加入原代培养液3ml，在22°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第10 天细胞开始从组织块中迀移，40天长成细胞单层。
[0038] 3.传代培养
[0039] 原代肌肉细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶 中的原代培养液，加入〇. 2 %的胰蛋白酶和0. 2 %的EDTA溶液I. 5ml，消化2分钟，细胞变圆 后，加入传代培养液2ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按1:1 传，此后按1:2进行传代，于22°C培养箱中继续培养；每7天传代一次，传至第10代时，细 胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至40代。
[0040] 4.细胞冻存与复苏
[0041] (a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO,按12:1的体积比混合， 现用现配。
[0042] (b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000 rpm离 心10分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为 I X IO6个/ml，将Iml细胞悬液转移至I. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°c 过夜，然后放入液氮中长期保存。
[0043] (c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化。 然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量DMEM基础培养液， 1000 rpm离心10分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细