胞培养瓶中，22°C培 养箱中培养，10天细胞即长成单层。
[0044] 实施例2
[0045] 1.制备消毒液和细胞培养液
[0046] 消毒液：向平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素浓度为150μg/ml，硫酸链 霉素的浓度为150 μ g/ml，两性霉素 B的浓度为20 μ g/ml。
[0047] 基础培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的10%。
[0048] 原代培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的 20%，使硫酸卡那霉素浓度为150 μ g/ml，硫酸链霉素的浓度为150 μ g/ml，两性霉素 B的浓 度为 20 μ g/ml。
[0049] 传代培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的 10%，使硫酸卡那霉素浓度为100 μ g/ml，硫酸链霉素的浓度为100 μ g/ml，两性霉素 B的浓 度为 10 μ g/ml。
[0050] 调节上述培养液的pH值为7. 3,放置于4°C冰箱中保存备用。
[0051] 2.原代培养
[0052] 先用8mg/L高锰酸钾浸泡软鳍新光唇鱼15分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒后， 以75%酒精再次消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肌肉，置于12孔板 中，加入平衡盐溶液消毒液浸泡肌肉组织。浸泡15分钟后，将肌肉组织用平衡盐溶液消毒 液清洗5次，剪成组织小块，并将其接种于25cm 2细胞培养瓶中，在26°C培养箱中倒置过夜， 次日再加入原代培养液3ml，在26°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第8 天细胞开始从组织块中迀移，30天长成细胞单层。
[0053] 3.传代培养
[0054] 原代肌肉细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶 中的原代培养液，加入〇. 2 %的胰蛋白酶和0. 2 %的EDTA溶液I. 5ml，消化2分钟，细胞变 圆后，加入传代培养液2-3ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代 按1:1传，此后按1:2进行传代，于26°C培养箱中继续培养海5天传代一次，传至第10代 时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至40代。
[0055] 4.细胞冻存与复苏
[0056] (a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO,按12:1的体积比混合， 现用现配。
[0057] (b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心8 分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为I X IO6 个/ml，将Iml细胞悬液转移至I. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°C过夜， 然后放入液氮中长期保存。
[0058] (c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化。 然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量DMEM基础培养液， 1000 rpm离心8分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，26°C培养 箱中培养，8天细胞即长成单层。
[0059] 实施例3
[0060] 1.制备消毒液和细胞培养液
[0061] 消毒液：向平衡盐溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素浓度为200 μ g/ml，硫酸链 霉素的浓度为200 μ g/ml，两性霉素 B的浓度为30 μ g/ml。
[0062] 基础培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清占总体积的15%。
[0063] 原代培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的 20 %，使硫酸卡那霉素浓度为200 μ g/ml，硫酸链霉素的浓度为200 μ g/ml，两性霉素 B的浓 度为 30 μ g/ml。
[0064] 传代培养液：向DMEM培养液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占总体积的 15%，使硫酸卡那霉素浓度为100 μ g/ml，硫酸链霉素的浓度为100 μ g/ml，两性霉素 B的浓 度为 15 μ g/ml。
[0065] 调节上述培养液的pH值为7. 4,放置于4°C冰箱中保存备用。
[0066] 2.原代培养
[0067] 先用10mg/L高锰酸钾浸泡软鳍新光唇鱼10分钟，对鱼进行整体消毒；整体消毒 后，以75%酒精再次消毒鱼体后，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其肌肉，置于12孔 板中，加入平衡盐溶液消毒液浸泡肌肉组织。浸泡15分钟后，将肌肉组织用平衡盐溶液消 毒液清洗5次，剪成组织小块，并将其接种于25cm 2细胞培养瓶中，在28°C培养箱中倒置过 夜，次日再加入原代培养液3ml，在28°C培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液， 第7天细胞开始从组织块中迀移，20天长成细胞单层。
[0068] 3.传代培养
[0069] 原代肌肉细胞铺满瓶底80%后开始传代。传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶 中的原代培养液，加入〇. 2 %的胰蛋白酶和0. 2 %的EDTA溶液I. 5ml，消化2分钟，细胞变 圆后，加入传代培养液2-3ml以中和胰酶反应，轻轻吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代 按1:1传，此后按1:2进行传代，于28°C培养箱中继续培养海5天传代一次，传至第10代 时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功。目前，细胞传代已传至40代。
[0070] 4.细胞冻存与复苏
[0071 ] (a)配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO,按12:1的体积比混合， 现用现配。
[0072] (b)细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心5 分钟，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为I X IO6 个/ml，将Iml细胞悬液转移至I. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°C过夜， 然后放入液氮中长期保存。
[0073] (c)细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化。 然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量DMEM基础培养液， 1000 rpm离心10分钟，除上清液。用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，28°C培 养箱中培养，6天细胞即长成单层。
[0074] 实施例4
[0075] 对实施例2的软鳍新光唇鱼的鱼体采用不同消毒方法进行比较。
[0076] 将实施例2中的软鳍新光唇鱼分别采用最常见的高锰酸钾浸泡消毒、亚甲基蓝浸 泡消毒和直接酒精消毒，其他步骤与实施例2中的步骤相同。结果表明（参见表1)，亚甲基 蓝浸泡消毒，组织块不易迀出细胞，易发生污染，而单独高锰酸钾细胞或酒精的迀出效果不 甚理想。
[0077] 当高锰酸钾浸泡和酒精消毒联合作用时，结果显示这样处理后的鱼体所得到的肌 肉细胞系污染率下降，对细胞的迀出也影响不大。
[0078] 表1.采用不同消毒方式的情况下组织块细胞迀出情况
[0079]
【主权项】
1. 一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤： 1) 软鳍新光唇鱼肌肉的获取：先用5-10mg/L高锰酸钾浸泡软鳍新光唇鱼10-20分钟， 对鱼进行整体消毒；整体消毒后，以75%酒精再次消毒鱼体后，加入平衡盐溶液消毒液浸 泡肌肉组织；浸泡15分钟后，将肌肉组织用消毒液清洗； 2) 原代培养：将所述肌肉组织剪成组织小块，并将其接种于细胞培养瓶中，在22-28°C 培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在22-28°C培养箱中启动原代培养，每三天半 量更换培养液，第7-10天细胞开始从组织块中迀移，20-40天长成细胞单层； 3) 传代培养：原代肌肉细胞铺满瓶底80%后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养 液，以含0. 2%的胰蛋白酶的胰酶消化法传代悬起细胞，首次传代按1:1传，此后按1:2进行 传代，于22-28°C培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基 础培养液，所述软鳍新光唇鱼肌肉细胞系建立成功。
2. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述消毒液为含有浓度为100-200 y g/ml的硫 酸卡那霉素、浓度为100-200 y g/ml的硫酸链霉素以及浓度为10-30 y g/ml的两性霉素B 的平衡盐溶液。
3. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述基础培养液为含有占总体积的10-15%的 胎牛血清的DMEM培养液。
4. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述原代培养液为含有占总体积的15-20%的 胎牛血清、浓度为100-200 y g/ml的硫酸卡那霉素、浓度为100-200 y g/ml的硫酸链霉素以 及浓度为10-30 y g/ml的两性霉素B的DMEM培养液。
5. 如权利要求1所述的构建方法，其中所述传代培养液为含有占总体积的10-15%的 胎牛血清、浓度为50-100 y g/ml的硫酸卡那霉素、浓度为50-100 y g/ml的硫酸链霉素以及 浓度为5-15 y g/ml的两性霉素B的DMEM培养液。
6. 如权利要求1-5所述的构建方法，其中溶液的pH值为7. 2-7. 4。
7. 如权利要求1-5所述的构建方法，该构建方法还包括如下细胞冻存与复苏的步骤： 1) 配制细胞冻存保护液：冻存液包括胎牛血清和DMSO,按12:1的体积比混合，现用现 配； 2) 细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1000-1200rpm离 心5-10分钟，弃掉上清液；向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度约为 I X IO6个/ml，将Iml细胞悬液转移至I. 8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，-80°C 过夜，然后放入液氮中长期保存； 3) 细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37°C水浴锅中快速摇晃至融化；然后 在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量DMEM基础培养液，1000 rpm 离心5-10分钟，除上清液；用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，22-28°C培养 箱中培养，7天细胞即长成单层。
【专利摘要】本发明涉及一种软鳍新光唇鱼肌肉细胞系的构建方法，该构建方法包括如下步骤：1)软鳍新光唇鱼肌肉的获取：高锰酸钾和酒精联合对鱼体进行消毒；2)原代培养：采用含有硫酸卡那霉素、硫酸链霉素以及两性霉素B的DMEM培养液进行培养；3)传代培养：传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述软鳍新光唇鱼肌肉细胞系建立成功。本发明的构建方法所获得的软鳍新光唇鱼肌肉细胞系形态为不规则多角形，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对软鳍新光唇鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要。
【IPC分类】C12N5-071, C12R1-91
【公开号】CN104805052
【申请号】CN201510204471
【发明人】王晓爱, 潘晓赋, 杨君兴, 刘倩
【申请人】中国科学院昆明动物研究所
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月27日