一种气微菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种气微菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 气微菌属由 Miller 等在 1991 年建立，模式种为 NRRL Β-3381τ。到现在为止，气微菌属共包括11个种，分离自土壤、空气、海洋和牧草等环境。2005 年，由Yoon等对气微菌属的相关特性做了修正。好氧生长，不产芽孢，细胞呈杆状或球状， 中温，主要的脂肪酸为10-甲基C18:0，C16:0，C 18:1〇9c和（或）C16:Q2-OH。气微菌属G+C 含量范围为70. 6~73mol%〇
[0003] 多相分类的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信 息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合起来研宄微生物分类和系统进化的过 程。其中DNA同源性分析是确定正确的分类地位的最直接的方法，而DNA-DNA杂交可以在 总体水平上研宄微生物间的关系，用于种水平上的分类学研宄。1987年，国际系统细菌学委 员会（International Committee on Systematic Bacteriology, ICSB)规定，DNA 同源性 多70%为细菌种的界限。
[0004] 气微菌属的很多微生物可产生多种生物活性物质，如酶、抗菌物质、絮凝剂以及牛 磺胆酸，因此在工农业生产中具有很好的应用潜力。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种气微菌，该气微菌为SEQ ID NO. 1所示的碱基序 列。
[0006] 本发明的目的之二在于提供该气微菌在液体发酵生产蛋白酶和酯酶中的应用。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种气微菌，该菌株的保藏号为CGMCC No. 9738。
[0008] -种上述的气微菌的培养方法，其特征在于该方法是将气微菌YS17 CGMCC No. 9738接种于培养基中，在15-50°C，pH5. 5-12. 0的条件下进行培养。
[0009] 上述最适培养温度为30-37 °C。
[0010] 上述最适 pH 为 7. 0-8. 0。
[0011] 上述的培养的培养基中还包括质量百分比浓度不超过11%的NaCl。
[0012] 上述的培养在需氧条件下进行。
[0013] 一种根据上述的气微菌在液体发酵生产蛋白酶和酯酶中的应用。
[0014] 本发明所述的培养可以是各种微生物的培养方式，比如液体培养、固体培养、半固 体培养等，可以是摇床培养，也可以是发酵罐深层发酵，优选的摇床培养。
[0015] 本发明所述的培养的接种量为常规，优选2%，所述百分比为体积百分比。
[0016] 本发明所述的培养基为气微菌常规培养基，优选是TYB培养基。
[0017] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0018] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0019] 本发明的积极进步效果在于：本发明提供了气微菌属的一个新种，该菌株的分类 地位是，依照国际细菌系统分类委员会的命名方法，欲将该种命名为 caffieBiae sp.nov.。该新种的发现和利用丰富了我们的可利用微生物资 源，对我们以后更好地利用气微菌做出了一定的贡献。本发明的气微菌YS17,可提取酯酶和 蛋白酶，在食品、医药和化工等行业具有有广泛应用。
[0020] 生物材料保藏信息 本发明的气微菌YS17,已于2014年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研宄所，邮编：1〇〇1〇1。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.9738。该菌株的分类命名是气微 菌乂a?sp.，名称为 YS17。
【附图说明】
[0021] 图1显示本发明气微菌新种菌株YS17的16S rRNA系统发育进化树。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0023] Jeroffiicro办ia? e/yiAre應DSM 8599τ购自德国微生物菌种保藏中心， Aeromicrobium alkaliterrae 为W Aeromicrobium ginsengisoli 14732? 自曰本微生物菌种保藏中心。
[0024] 实施例1、本发明新菌株YS17的分离制备 取普洱熟茶浸出液，将其稀释涂布于LB固体培养基中，30°C培养5-6天，挑取单菌落， 然后划线纯化得到。
[0025] 将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，其保藏编 号为 CGMCC No. 9738。
[0026] 实施例2、本发明新菌株YS17的表观特征 1.菌落特征 取菌株YS17的单菌落，转接到TYB固体培养基(琼脂）上，于30°C恒温培养箱中培养 24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。结 果显示，菌株YS17在TYB固体培养基上形成边缘整齐，光滑，湿润，不透明，黄色的菌落，直 径约1mm。
[0027] 2.细胞形态学特征 细胞为短杆，顶端圆钝；革兰氏染色阳性；细胞菌体大小为〇. 3-0. 5 μ mXO. 9-1. 6 μ m， 单生。
[0028] 实施例3、本发明新菌株YS17的生长特性 挑取在TYC固体培养基(琼脂)上培养24 h的新鲜培养物，接种到TYB液体培养基，37°C 摇床培养20~24h，作为种子。
[0029] 液体TYB培养基的组成（/L):胰蛋白胨15g，NaCl 5g，大豆蛋白胨5g，蒸馏水定容 至 1000 ml0
[0030] L生长温度： 将所培养的YS17种子按2%(v/v)接种量转接新鲜的无菌接种TYB (液体培养基中，混 匀。分别置于 4°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、37°C、40°C、45°C、50°C和 60°C 的水浴培养， 每个温度梯度做三个平行，分别在24 h和48 h时测定其生长情况。得到菌株YS17生长温 度范围为15~50°C，最适温度30~37°C。
[0031] 2.生长NaCl耐受性 所培养的YS17种子按2%(v/v)接种量转接氯化钠浓度分别为0. 0%、2. 0%、 5.0%、7.0%、9%、10.0%、11.0%和12.0%的了￥8培养基，30°〇培养，分别于24 11和48 11的 生长状态做记录。结果显示菌株YS17的NaCl耐受性为11%。
[0032] 3.生长pH范围 用无菌的lmol/L HCl和lmol/L NaOH将灭好菌的TYB培养基调至pH值分别为3. 0、 4· 0、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、8· 0、8· 5、9· 0、10· 0,将所培养的 YS17 种子按 2% 接种量接入， 30°C培养，分别于24 h和48 h的生长状态做记录。得到菌株YS17生长的pH范围为 5. 5~12· 0,最适 pH 为 7. 0~8· 0。
[0033] 实施例4、本发明新菌株YS17的生理生化特性 利用API ZYM和API20E鉴定系统（生产厂商：bioMe' rieux)及常规的生理生化测定 方法(东秀珠，蔡妙英等，2001)对菌株YS17及相关的同属菌株进行生理生化特征鉴定。
[0034] 菌株YS7的主要生理生化特征：好氧生长；接触酶阳性；核酸酶阴性；β -半乳糖 苷酶阴性，精氨酸双水解酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，脲酶阴性，酯酶 (C4)阳性，类脂酯酶（C8)阳性，胰凝乳蛋白酶阳性，不产生吲噪，VP反应阳性，水解Tween 60,不水解七叶灵；不液化明胶；不水解酪蛋白；不水解淀粉；还原硝酸盐；能利用葡萄糖、 甘油、蔗糖、、果糖、海藻糖、L-谷氨酸等作为碳源；不利用阿拉伯糖、乳糖、鼠李糖、木糖、甲 酸、纤维二糖、延胡索酸、柠檬酸盐、L-鸟氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、L-丙 氨酸、DL-天冬酰胺、甘氨酸、赖氨酸与组氨酸等底物。
[0035] 且菌株YS17在吲哚产生，胰凝乳蛋白酶活性及硝酸盐还原等方面与同源性接近 Aeromicrobium erythreum DSM 8599T, Aeromicrobium alkaliterrae JCM 13518τ 和 Jeroffiicro办ia? JCM 14732τ具有明显差异。
[0036] 实施例5、本发明新菌株YS17 (CGMCC No. 9738)的16S rRNA基因的PCR扩增和序 列测定及16S rRNA系统发育特征。
[0037] 1.提取基因组DNA 将气微菌JerofflicroWw? 5/7. YS17 (CGMCC No. 9738)接种于TSB液体培养基，将生长 至对数晚期的发酵液，12000转/分钟离心1分钟，去除上清液；用TES (50 mM Tris，50 mM EDTA-Na2, 50mM NaCl，pH 8. 0-8. 2)溶液洗3遍；用0. 4mL TES溶液将菌体混匀，加入适量溶 菌酶，37°C保温1小时；加入0· 04 mL20%SDS，60°C保温30分钟；加入0· 18 mL 5M NaClO4, 混匀；加入等体积氯仿-异戊醇（24: 1)，轻轻摇匀1分钟左右，离心（12000转/分钟，10分 钟)，吸取上清液；上清液加入20 μ 1 0. 2 % RNA酶37 °C保温30分钟，氯仿-异戊醇（24: l，v/v)处理一遍；上清液加入20 μ 1蛋白酶K (50-70 μ g/mL)，37°C保温1小时，氯仿-异 戊醇（24: I，v/v)处理一遍；上清液用2倍体积冰乙醇沉淀，70%冰乙醇溶液浸泡5分钟， 12000/分钟离心5分钟。晾干后溶于无菌水中作为模板DNA。
[0038] 2. 16S rRNA基因的PCR扩增及测序 用于？0?扩增的正向引物为5'-六6六61'176六了0^66(：11^6-3'（1^8-27)，反向引物为 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'（nt 1541-1557)，分别对应于大肠杆菌的 16S rRNA 基因的 8-27 和 1541-1557 碱基。PCR 反应体系（20 μL)为：10Xbuffer 2μ1、25 mmol/L MgCl22yl、 10 mmol/L dNTPs 1·5μ1、30 pmol/L 引物各 lyl、ddH20 13.4yl、Taq DNA 酶 ΙμL、模板 14 1。？0?反应条件为：95°〇1〇111丨11，95°〇1111丨11，55°〇1111丨11，72°〇1111丨113〇8,30个循环 ； 72°C 10 min，4°C保存。
[0039] PCR 产物