根际促生菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种根际促生菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 小麦为禾本科植物，世上分布最广粮食作物，播种面积为粮食作物之冠。2010年， 其在世界上总产量达6. 51亿吨，仅次于玉米的8. 44亿吨。同时小麦是中国最重要的口粮 之一，主要产于河南、山东、江苏、河北、湖北、安徽等省，小麦产业发展直接关系到国家粮食 安全和社会稳定。然而，在我国科学技术对此作物的提高作用远低于种植面积的减少幅度。
[0003] 在农业生产中，化肥的使用提高了小麦产量，然而也向环境释放了大量的有害物 质，污染了土壤、水源以及食品本身，对人类健康及生存环境也构成了极大威胁。因此，适应 绿色农业以及农业可持续发展的需求，开发利用替代化学肥料的新肥源成为当务之急。
[0004] 根际促生菌是自由生活在根围土壤或附生于根表、根内的可促进植物生长及其对 矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。根际促生菌可以通过一种或多种 机制直接或间接的促进植物生长。通过固氮、解磷、解钾、产植物激素、酶解降低乙烯等作 用，增加土壤养分，促进根系对矿质的吸收利用，直接刺激和调节植物生长；另一方面，通过 产生抗生素和分泌铁载体、HCN等物质，其可以抑制土壤中有害病原微生物，间接的保护和 促进植物生长。接种根际促生菌，不但能够减少化肥农药的使用，也能减轻因大量使用化肥 农药而造成的环境污染和食品安全问题。自1990第四届国际植物细菌年会上Keleopper 等人在法国召开的做了有关根际促生菌的报告后，应用根际促生菌促进植物生长，提高农 作物产量的研宄再次引起人们的极大关注。目前，人们已经从玉米、小麦、苜蓿、甘蔗、水稻 及多种牧草等的根际中，筛选到多种具有优良特性的促生菌株，在温室和田间接种试验中 取得良好的促生效果。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种根际促生菌及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种根际促生菌，根际促生菌为根际促生菌N10,其分类命名为生癌肠杆菌 (Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 1. 14969,保藏单位地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0008] -种根际促生菌的应用，所述根际促生菌应用于促进植物生长中。
[0009] 进一步的说，所述根际促生菌应用于促进小麦生长中。
[0010] 更进一步的说，所述根际促生菌应用于促进小麦生长中，作为接种剂（促生剂）或 微生物菌肥。
[0011] 具体是，将OD6c?为0. 8的经LB培养基中驯化培养的Iml生癌肠杆菌液（根际促生 菌N10)作为作为接种剂（促生剂）或微生物菌肥喷在发芽的小麦种子表面，温室下培养， 进而促进小麦生长；
[0012] 其中，小麦种子是经浸泡后温育发芽的小麦种子转移种于灭菌的拌有低氮-磷酸 妈培养液中；
[0013] 所述灭菌的拌有低氮-磷酸钙培养液承装于蛭石的双层钵中；
[0014] 所述低氮-磷酸妈培养液成分：去离子水1L，梓檬酸铁（ferric citrate) 0. 075g， Ca(NO3)20.0 3g, KCl 0· 075g，MgSO4 · 7H20 0· 06g，Ca3 (PO4) 25g, CaSO4 0· 46g，微量元素 ImL ;
[0015] 所述微量元素组分：去离子水 1L，H3B032.86g，MnSO4L 81g，CuSO4 · 5H200.8g， ZnSO4O. 22g, H2MoO40.0 2g，pH 至 7· 0。
[0016] 所述室温培养的条件为温度控制在26±2°C，光照周期12h:12h。
[0017] 上述所述双层钵设计：上层为透明塑料杯盛蛭石，下层为宽口玻璃瓶盛灭菌水，塑 料杯底部开孔，一根粗棉芯穿过开孔，上部埋在蛭石中央，下部伸到无菌水中。
[0018] 其中菌株可用于制备促进小麦生长的微生物接种剂。
[0019] 所述菌株可用于制备微生物菌肥，其有使固氮、溶磷、产吲哚乙酸能力，能增加土 壤含氮量，提高土壤营养有效性，减少化肥施用量。
[0020] 具体是，菌株能够将空气中的氮气还原成氨态氮，具有自生固氮能力。
[0021] 菌株具有强的溶磷能力，能将磷酸钙转化成易于被植物吸收的可溶性磷酸盐。
[0022] 菌株能够合成和分泌吲哚乙酸。
[0023] 本发明所具有的优点：
[0024] 本发明根际促生菌具有固氮、解磷、产吲哚乙酸的促生特性，可以增加土壤养分， 提高肥料有效性，促进植物对土壤养分吸收，具有开发成促进农作物生长的微生物接种剂 或微生物菌肥。其固氮能力达16.36nmol(C2H2mg 4protein IT1);摇床温育培养下，其10 天后磷酸钙转化量比不接菌的空白对照高出254. 58mg L-1，吲哚乙酸60h后产量1. 10 μ g ml 1O
[0025] 进而所获得菌株对小麦具有显著的促生效果，菌株良好地促生特性促进了小麦地 上部的生长。接入菌株的小麦地上部干重增长60. 87%，鲜重增长57. 14%，均达到统计学 的显著水平，并且没有可见的病变表征。另外，在营养相对缺乏的培养环境下，该根际促生 菌能显著地促进小麦的生长。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例提供的根际促生菌NlO在LB培养基培养1天上的菌落形态。
[0027] 图2为本发明实施例提供的根际促生菌NlO在PVK固体培养基培养5天解磷透明 圈。
[0028] 图3为本发明实施例提供的温室培养50天后，接菌小麦与不接菌小麦生长状况对 比及双层钵展示照片。
[0029] 图4为本发明实施例提供的温室培养50天后，接菌小麦与不接菌小麦干重对比 图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1
[0031] 菌株的鉴定
[0032] 将根际促生菌NlO在LB培养基上28°C培养箱中扩大培养，观察菌落特征：菌落顶 部平，凸起，半透明，乳白色，表面较湿润。
[0033] 所述根际促生菌为根际促生菌N10,其分类命名为生癌肠杆菌（Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（CGMCC)，保藏号为 CGMCC No. 1. 14969。
[0034] 挑取菌落收集菌体，用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，依据内附说明书提取所 述菌株基因组DNA，保存于-20 °C冰箱备用。
[0035] 16S rRNA gene PCR:
[0036] ①引物 27F :AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，1492R :TACGGCTACCTTGTTACGACTT。
[0037] ②反应体系：25uL天根PCR Mix，IuL引物27F，luL1492R引物，IuL提取的DNA， 22uL灭菌超纯水。
[0038] ③PCR反应条件为：95°C变性5min ;94°C变性lmin，58°C退火lmin，72°C延伸 lmin，从第二步开始30个循环.PCR产物序列测定委托上海生工生物技术有限公司完成，参 见序列表SEQ ID No. 1。
[0039] 序列表 SEQ ID No. 1
【主权项】
1. 一种根际促生菌，其特征在于：根际促生菌为根际促生菌N10,其分类命名为生癌肠 杆菌（Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 1. 14969。
2. -种权利要求1所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述根际促生菌应用于促 进植物生长中。
3. 按权利要求2所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述根际促生菌应用于促进 小麦生长中。
4. 按权利要求3所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述根际促生菌应用于促进 小麦生长中，作为接种剂（促生剂）或微生物菌肥。
5. 按权利要求4所述的根际促生菌的应用，其特征在于：将OD _为0. 8的经LB培养基 中驯化培养的Iml生癌肠杆菌液（根际促生菌N10)作为作为接种剂（促生剂）或微生物 菌肥喷在发芽的小麦种子表面，温室下培养，进而促进小麦生长； 其中，小麦种子是经浸泡后温育发芽的小麦种子转移种于灭菌的拌有低氮-磷酸钙培 养液中。
6. 按权利要求5所述的根际促生菌的应用，其特征在于： 所述灭菌的拌有低氮-磷酸钙培养液承装于蛭石的双层钵中； 所述低氮-磷酸1?培养液成分：去离子水1L，梓檬酸铁（ferric citrate)0. 075g， Ca(NO3)2 0.03g, KCl 0.075g，MgSO4 .7H20 0.06g，Ca3(PO4)2 5g, CaSO4 0.46g，微量元素 ImL ； 所述微量元素组分：去离子水 1L，H3BO3 2. 86g，MnSO4 I. 81g，CuSO4 ? 5H20 0? 8g，ZnSO4 0? 22g, H2MoO4 0? 02g，pH 至 7. 0。
7. 按权利要求5所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述室温培养的条件为温度 控制在26±2°C，光照周期12h:12h。
【专利摘要】本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种根际促生菌及其应用。根际促生菌为根际促生菌N10，其分类命名为生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1.14969。本发明菌株具有固氮、解磷、产吲哚乙酸的促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料有效性，促进植物对土壤养分吸收，具有开发成促进农作物生长的微生物接种剂或微生物菌肥的良好前景。本发明针对小麦具有显著的促生效果，菌株良好地促生特性促进了小麦地上部的生长。CGMCC No. 1.1496920150325
【IPC分类】C12N1-20, C05F11-08
【公开号】CN104805045
【申请号】CN201510224643
【发明人】解志红, 李项岳, 李岩, 宫江峰, 姜楠
【申请人】中国科学院烟台海岸带研究所
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月5日