一种耐重金属植物根际促生菌新种Burkholderia sp.D414及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于重金属污染环境的生物修复技术领域，具体涉及一种重金属（铅、镉、 铜、锌）耐性植物促生菌新种及其应用。
【背景技术】
[0002] 由于人类工业活动导致土壤中重金属元素含量增加，重金属元素能够通过作物吸 收与富集的方式，通过食物链最终影响人类健康。植物通过根系从土壤吸收生长必须营养 元素，在重金属污染土壤中，根系是首先暴露于重金属胁迫的植物器官，也是最先受重金属 毒害的植物器官。与此同时，根际土壤中存在着数量和种类丰富的微生物种群，它们与植物 根系以及土壤形成特殊微环境，是根际土壤中最重要的生物因素。研宄发现，植物根际促生 菌能够产生植物生长激素促进植物生长，改变根际微环境中重金属元素生物有效性，强化 重金属污染土壤植物修复效率。因此，分离筛选具有多种重金属耐受性，促进植物生长的优 良植物根际促生菌新种，并研发相应功能菌剂对于土壤重金属污染修复具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一株具有多重金属耐受性植物根际促生菌新种Burkholderia sp.D414,以及含有该菌株的植物促生菌剂及其应用。
[0004] 1.本发明从典型重金属复合污染稻田土壤中分离筛选出具有多种重金属耐受 性，且具有较强植物促生特性的植物根际促生菌新种D414,分类命名为伯克霍尔德氏菌 属（Burkholderiasp.D414)。2013年2月05日保藏于布达佩斯条约承认的生物材料样 品国际保藏单位"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH， (DSMZ，德国微生物保藏中心）"，地址：LeibnizInstituteDSMZ-GermanCollection ofMicroorganismsandCellCulturesInhoffenstra0e7B38124Braunschweig Germany(德国不伦瑞克市德国莱布尼茨DSMZ微生物和细胞培养物保藏中心，38124)，保藏 号为DSM26823。
[0005] 2.本发明所述耐重金属植物根际促生菌新种Burkholderiasp.D414,通过梯度稀 释法分离自典型重金属复合污染稻田土壤。该菌株对铅、镉、铜和锌多种重金属具有耐受 性。
[0006] 菌株D414形态特性描述如下：菌体大小为0.5-0. 7X0. 8-2.0ym，革兰氏阴性， 好氧，如图 1 所示。在分离培养基（SMN) : (NH4)2S04,Sgl'Mannitol，58112册04, 0? 5grS MgS04, 0?SgrSNaCl，0?lgl、FeS0 4, 0?OSgl'MnSO4, 0? 05grS琼脂粉 20gl、去离子水 1000mL;pH6.8±0. 2上形成单菌落呈黄白色，圆形凸起且具有清晰边缘。菌株D414能够 在10-50°C范围生长，其中最适生长温度为30°C，菌株D414能够在pH3. 0-8. 0范围内生长， 最适生长pH为7.0。
[0007] 菌株D414生理生化特征描述如下：菌株D414能够在无N阿须贝（Ashby's NitrogenFreeMedium)培养基上生长，吲噪阳性，具有脲酶，氧化酶，过氧化氢酶，硝基半 乳糖酶活性，于此同时具有1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC)脱氨酶活性，能够利用七叶灵， 葡萄糖，阿拉伯糖，甘露糖，甘露醇，N-乙酰葡糖胺，苹果酸酯，葡糖酸盐，正癸酸，己二酸，柠 檬酸盐，乙酸苯酯，D-核糖，D-木糖，D-核糖醇，D-果糖，D-鼠李糖，肌醇，山梨醇，水杨苷， D-纤维二糖，D-蜜二糖，D-龙胆二糖，D-来苏糖，海藻糖，D-阿拉伯醇。菌株D414硝酸盐 还原反应阴性，明胶水解阴性，不能够利用精氨酸，赤藓糖醇，L-木糖，甲基-吡喃型木糖 苷，L-山梨糖，己六醇。苦杏仁苷，熊果苷，D-乳糖，D-蔗糖，菊粉，D-松三糖，D-棉籽糖， 淀粉，糖原，木糖醇，D-塔格糖，L-阿拉伯醇，葡糖酸钾，2, 5-酮葡糖酸。
[0008] 菌株D414分类学特征描述如下：提取菌株D414纯培养物基因组DNA，采用正向引 ^JPl:5'-egggatccagagtttgatcctggcteagaaegaaegct_3'i向弓|^Jp6:5'-egg gatcctaeggetaccttgttaegaettcacccc_3'PCR法扩增菌株D414 的 16SrDNA序 列。PCR产物纯化后测序，结果通过比对GenBank/EMBL/DDBJdatabases和EzTaxon-e数 据库收录细菌16SrDNA序列。通过构建基于16SrDNA序列的系统进化树（图2所示）， 细胞壁脂肪酸分析，全细胞蛋白电泳（SDS-PAGE)(图3所示），DNA-DNA杂交，生理生化特 征比较等多项分类法研宄，结果表明，菌株D414细胞壁脂肪酸构型主要为：C14:(l，C16:(l，C17:Q cyclo,和C18:1?7c.基因组DNAG+C含量为62.3±0.5mol%。菌株D414与已有效命名的 Burkholderia菌属模式株BurkholderiatropicaDSM153591,Burkholderia.bannensis NBRCE25T，BurkholderiaunamaeDSM17197T 16SrDNA序列相似性分别为 98.5%，98.3% 和98. 3%。综上多项分类学研宄结果可见，菌株D414与有效命名的Burkholderia菌属模 式株间存在显著差异，菌株D414为Burkholderia菌属一个新种，根据国际微生物菌种命名 法命名为Burkholderiametalliresistens模式株为D414,现分别保藏于"德国微生物保藏 中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ) "，保藏号 为DSM26823和中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC)保藏号CICC10561。
[0009] 3.本发明同时提供了一种含有以上所述菌株的耐重金属植物促生菌制剂及其应 用，所述的促生菌制剂为液体制剂，制剂中含有以上所述菌株的有效活菌数量为10-15亿 个/毫升，应用方法是将所述植物促生菌剂稀释200倍浸泡植物种子1小时后播种，促进重 金属胁迫下植物正常生长发育。
[0010] 本发明的优点和积极效果：
[0011] 本发明所述菌株D414具有多种重金属（铅、镉、铜、锌）耐受性，且能产生植物生 长激素IAA，固氮，溶解难溶性无机磷酸盐，可以缓解重金属毒害显著提高接种植物生物量。 其具体功能如下：
[0012] 1.重金属污染土壤植物根际促生菌新种的发现
[0013] 根际土壤中存在着数量和种类惊人的微生物种群（每克土壤中存在4,000~10， 〇〇〇种原核微生物，总数约2X109个），它们与植物根系以及土壤形成特殊土壤微环境，是 植物根际土壤中最重要的生物因素。其中只有约不到10%为人类所知。因此，1)分离筛选 根际有益微生物新种能够丰富我们对这个数量和种类惊人的微观世界的认识；2)通过研 宄这些微生物新种生理特征，能够促进我国农业安全生产技术，有助于提升我国农田污染 修复技术水平。
[0014] 2.植物促生特性
[0015] 重金属污染农田常体现出，土壤质量下降，作物养分利用率低等特征。本发明所述 菌株D414具有较强难溶性无机磷酸盐增溶能力，能够促进宿主作物对无机营养元素如磷、 钾的吸收利用效率，同时通过产生植物生长素IAA与联合固氮作用促进作物根系生长，增 加根系吸收面积，从而促进作物生长发育。
[0016] 3.缓解植物重金属毒害
[0017] 重金属元素对植物的毒害体现在植物体内乙烯含量升高，较高浓度乙烯能够显 著抑制植物细胞分裂，负调控植物生长，最终可导致植物生长受到明显抑制。1-氨基环丙 烷-1-羧酸（ACC)作为乙烯合成前体物质对于调控植物体乙烯浓度具有重要意义。本发明 所述