专利名称：重金属超富集植物印度芥菜的高效农杆菌遗传转化方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域；特别涉及一种重金属超富集植物印度芥菜的高 效农杆菌遗传转化方法。
背景技术：
印度芥菜(Sm^/a^'w"c^. L)属于芥菜型油菜，广泛分布于中国、印度、巴 基斯坦以及东南亚各国，是一种重要的油料经济作物。与白菜型油菜和甘蓝型油菜 相比，印度芥菜具有较强的抗旱、寒能力，同时又具有富集Cd、 Cr、 Ni、 Zn、 Oi、 Au和Se等多种重金属能力，在清除污染土壤和水体中重金属和放射性物质应用 中前景广阔，是目前研究重金属富集分子机理和开发植物修复技术的主要物种之 一。印度芥菜是一种典型的重金属超富集植物，在茎叶部能够富集400毫克/千克 (干重)以上的Cd，超过Cd的超富集标准(大于100毫克/千克)。在较低或边 缘过量Cd浓度范围内(100-250微克/毫升)，Cd还能促进印度芥菜的生长。Pb在 印度芥菜中的富集量可达其干重的3.5%，在富铅土壤中(2500毫克/千克)，每千 克土壤添加22.0克的EDTA可使印度芥菜茎叶中Pb含量从40毫克/千克，提高 到10,600毫克/千克。此外，印度芥菜还具有较强的硒富集和生物转化作用，其 硒酸盐含量可达1575毫克/千克，占总硒量的75%，有机硒含量可达630毫克/千 克，占总硒量的25%，而且没有其他毒性化合物生成，是补硒的理想物质。印度 芥菜在含金土壤中生长得特别茂盛，根系特别善于吸收土壤中的Au、Ni等贵金属， 喷洒硫氰酸铵溶液，能迅速溶解土壤中的黄金，从而能提高近5倍的黄金吸收量。 在切尔诺贝利核电站附近遭受核辐射污染的土壤，印度芥菜生长得很旺盛，美国 一些科学家认为利用印度芥菜和向日葵可以清除其周围大约90%的放射性物质Cs 和Sr。为了进一步提高印度芥菜的重金属抗性和富集能力，开发植物修复技术， 转基因技术是改善其性状的首选方法。然而，由于印度芥菜转化手段不成熟，转
化效率很低，限制了其在生产上的应用。^n何利用现代生物技术在短期内获得大量健壮的转基因幼苗，成为国内外急切解决的问题。 发明内容本发明的目的在于提供一种重金属超富集植物印度芥菜的高效农杆菌遗传转化 方法，以满足印度芥菜转基因研究和生产实际应用的需求。本发明的技术方案如下 本发明提供的重金属超富集植物印度芥菜的高效农杆菌遗传转化方法，其歩骤如下1)建立初代培养物一印度芥菜幼苗取印度芥菜成熟种子，用酒精进行表面消毒，之后，置于氯化汞中浸泡后取 出；再进行无菌水冲洗，灭菌，并用滤纸吸千其表面水分；再置于种子萌发培养基上培养5 — 15天，得初代培养物一印度芥菜幼苗；其 培养条件为光照强度为3000—5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20—25i:;所述种子萌发培养基为MS培养基；2) 印度芥菜幼苗的预培养将上述印度芥菜幼苗切取长5—7毫米左右的下胚轴段、3—5毫米的子叶柄段或 3—5平方毫米的子叶作为外植体；将所述外植体分别平铺在预培养培养基上进行预 培养2—3天，至外植体膨大；其预培养条件为光照强度为3000—5000勒克斯，光 照时间16小时/天，温度20—25。C;所述预培养培养基所含组分及配比为每升预培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0 —8毫克，蔗糖10—40毫克，琼脂1一10毫克，乙酰丁香 酮100毫摩尔和6—苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1 —8毫克，pH =5.8; 所述预培养基本培养基为MS培养基；3) 农杆菌的活化分别挑取带有双子叶植物表达载体的农杆菌单菌落，接种到5毫升LB农杆菌 液体培养基中培养8小时；其培养条件为28i:， 200转/分；取培养过夜的LB农杆菌培养液，按1: 40的比例稀释至20毫升LB液体农杆菌 培养基中，继续培养5—6小时'，至OD6oo为0.6;经5000转/分，离心5 min;收集菌体，用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD6oo为0.15侵染液体培养基；备用；
所述LB液体农杆菌培养基所含组分A配比为每升LB基本培养基中含利福 平50毫克和卡那霉素50毫克； 所述LB基本培养基所含组分及配比为每升农杆菌基本培养基中含10克的 胰蛋白胨，IO克的酵母提取物，IO克的氯化钠LB液体培养基，50毫克的利福平 和50毫克的卡那霉素；pH=7.0;所述侵染液体培养基为MS培养基，pH=5.2; 4)经预培养的印度芥菜幼苗的农杆菌侵染和共培养将预培养2—3天的印度芥菜幼苗的下胚轴段、子叶柄段或子叶置于上述含有 农杆菌的OD6oo为0.15的侵染液体培养基中，浸泡5 — 15分钟后取出；用滤纸吸 干附着其表面的菌液，平铺在共培养培养基上，25C下，暗培养2天；所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含水解乳蛋 白300毫克，硝酸银0 — 8毫克，蔗糖10—40毫克，琼脂5 — 10毫克，乙酰丁香 酮100毫摩尔和6—苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1—8毫克,pH =5.2;所述共培养基本培养基为MS培养基；5) 前培养将步骤4)培养后的印度芥菜幼苗的下胚轴段、子叶柄段或子叶取出，置于三角 瓶中；用无菌水冲洗3—5次后，再用含羧苄青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次， 每次10分钟；用含羧苄青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗1 一2次；将叶片取 出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹干；平铺于前培养基上培养3 — 15天；其培养 条件光照强度3000—5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20—25'C;所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0 — 8毫克，蔗糖10—40毫克，琼脂5 — 10毫克，羧苄青霉 素250毫克/升和6 —苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1—8毫克，pH =5.8;所述前培养基本培养基为MS培养基；6) 筛选培养将经前培养3 — 15天的印度芥菜幼苗的下胚轴段、子叶柄段和子叶取出，转移 至筛选培养基上；培养条件光照强度3000—5000勒克斯，光照时间16小时/天， 温度20—25'C; 21天继代一次，得试管丛生芽苗；所述筛选培养基所含组分友配比为每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300 毫克，硝酸银0—8毫克，蔗糖10—40毫克，琼脂5 —IO毫克，羧节青霉素250
毫克/升，卡那霉素5—25毫克/升和6 —苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各 0.1—8毫克，pH=5.8;所述筛选基本培养基为MS培养基；7)壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接 种到壮苗培养基中培养21—25天，得试管苗；所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含'蔗糖10—40毫 克，琼脂5 — 10毫克，羧苄青霉素250毫克/升和卡那霉素5 — 25毫克/升，pH=5.8; 所述壮苗基本培养基为MS培养基； 8)水培生根培养剪取经壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培生根培养；其培养条件为以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口'大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22 — 25 。C ，光照16小时/天，湿度80-85%;9)移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗圃基质中， 进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯 薄膜覆盖，保持湿度90_95%，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格 兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80%，温度20 一3(TC，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施l次尿素， 进行速生培养，完成印度芥菜转基因苗的培养。所述步骤1)中所述的种子萌发培养中所述的培养时间为5—9天时，效果较佳。所述歩骤2)，步骤4)，步骤5)和步骤6)中所述的预培养培养基，共培养培 养基和筛选培养基中所述的硝酸银为3—7毫克/升，蔗糖为25_40毫克/升，6— 苄基嘌呤为1.0—4毫克/升，萘乙酸为0.5—2毫克/升时，效果较佳。所述步骤5)中所述前培养时间为5—10天时，效果较佳。采用本发明方法进行稳定的重金属超富集植物印度芥菜的农杆菌转基因苗的培
养方法，可以在短期内得到大量健壮的阳性转基因幼苗，转化率高达68%，不受 外界环境条件影响，四季皆可进行。而且节约育苗占地，降低生产成本。植物组 织培养技术是利用细胞的全能性，采用植物体上的细胞团或一块组织，通过人为 条件的控制，使之形成大尊植株，并且保存了母体的全部优良性状，且遗传性状 稳定。通过这种方法得到的大畺健壮印度芥菜转基因试管苗，生长速度和生物量 没有变化，完全可以满足分子生物学研究和生产应用。
具体实施方式
下面结合农杆菌介导的印度芥菜遗传转化实施例进一步描述本发明实施例l:农杆菌介导的印度芥菜遗传转化 1、初代培养物的建立取印度芥菜成熟种子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1%氯化汞中浸泡8 分钟。无菌水冲洗3 — 5遍，灭菌滤纸吸干水分；置于种子萌发培养基上培养7天。 培养条件为光照强度为5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20'C。所述种子萌发培养基为MS培养基；2、 预培养以经萌发培养的印度芥菜幼苗为材料，切取长约5 — 7毫米下胚轴段作为外植 体，平铺在预培养培养基上，进行预培养2天。培养条件为光照强度为3000勒 克斯，光照时间16小时/天，温度20-25'C。所述预培养培养基所含组分及配比为每升增殖基本培养基中含水解乳蛋白 300毫克，硝酸银6毫克，蔗糖30毫克，琼脂6毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和 6—苄基腺嘌呤3毫克、萘乙酸l毫克，pH=5.8;所述预培养基本培养基为MS培养基；3、 农杆菌的活化分别挑取带有目的基因的双子叶植物表达载体的农杆菌的单菌落，接种到5 毫升农杆菌液体培养基中；28'C， 200转/分，培养8小时。取培养过夜的农杆菌，按l: 40的比例稀释至20毫升农杆菌液体培养基中， 继续培养5小时，至OD6oo为0.6;经5000转/分，离心5 min，收集菌体用侵染 液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD6QQ为0.15后备用。
所述农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升农杆菌基本培养基中含50毫 克利福平和50毫克卡那霉素；所述农杆菌基本培养基所含组分及配比为胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化钠10克/升的LB液体培养基，pH = 7.0;所述侵染液体培养基为MS培养基，pH=5.2; 4、植物材料的农杆菌侵染和共培养将经预培养的下胚轴段置于上述含有农杆菌的OD,为0.15的侵染液体培养 基中，浸泡8分钟后取出。用滤纸吸干附着在植物材料表面的菌液，平铺在共培 养培养基上;25'C，暗培养2天。所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含水解乳蛋 白300毫克，硝酸银6毫克，蔗糖30毫克，琼脂7毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔 和6 —苄基腺嘌呤3毫克、萘乙酸1毫克，pH=5.2;所述共培养基本培养基为MS培养基；5、 前培养将经共培养的下胚轴段取出，置于三角瓶中。用无菌水冲洗3 — 5次后，再用 含羧苄青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次，每次10分钟；用含羧苄青霉素500 毫克/升的MS液体培养基冲洗l一2次；将叶片取出，用滤纸吸干水分，超净工作 台中吹干。平铺于筛选培养基上；培养条件光照强度3000勒克斯，光照时间16 小时/天，温度20—25'C;培养15天。所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银6毫克，蔗糖30毫克，琼脂7毫克，羧苄青霉素250毫克/ 升和6 —苄基腺嘌呤3毫克、萘乙酸1毫克，pH=5.8;6、 筛选培养将经前培养的下胚轴段取出，转移至筛选培养基上。培养条件光照强度3000 勒克斯，光照时间16小时/天，温度25'C; 21天继代一次。所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300 毫克，硝酸银6毫克，蔗糖30毫克，琼脂7毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡那 霉素10毫克/升和6—苄基腺嘌呤3毫克、萘乙酸1毫克，羧苄青霉素250毫克/ 升，卡那霉素10毫克/升，pH=5.8; 所述筛选基本培养基为MS培养基；
7、壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接 种到壮苗培养基中培养25天；所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖30毫克， 琼脂7毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡那霉素10毫克/升，pH=5.8; 所述壮苗基本培养基为1/2MS培养基； 8、生根培养剪取经壮苗培养6-8厘米的试管苗，从培养基中取出，洗去附着的培养基，转 移至荷格兰特液体培养基中进行水培生根培养；其培养条件为以泡沫板作为幼 苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生； 每5天更换一次荷格兰特液体培养基；25°C，光照16小时/天，湿度80%; 9、移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米时取出，移栽到苗圃基质中，进行移 栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭石组成；幼苗移栽甜，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯 薄膜覆盖，保持湿度90 — 95%，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格 兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80%，温度20 一3(TC，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素， 进行速生培养，完成印度芥菜转基因苗的培养。实施例2:农杆菌介导的高效印度芥菜遗传转化 1、初代培养物的建立取印度芥菜成熟种子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1。/。氯化汞中浸泡8 分钟。无菌水冲洗3 — 5遍，灭菌滤纸吸干水分；置于种子萌发培养基上培养10 天。培养条件为光照强度为4000勒克斯，光照时间16小时/天，温度23t:;所述种子萌发培养基为MS培养基；2预培养以经萌发培养的印度芥菜幼苗为材料，切取长约3 — 5毫米子叶柄段作为外植 体，平铺在预培养培养基上，进行预培养3天。培养条件为光照强度为4000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20—25D。200610112515.6说明书第8/14页所述预培养培养基所含组分及配比为每升增殖基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银6毫克，蔗糖40毫克，琼脂10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和 6—苄基腺嘌呤3毫克、萘乙酸2毫克，pH=5.8;所述预培养基本培养基为MS培养基；3、农杆菌的活化分别挑取带有目的基因的双子叶植物表达载体的农杆菌的单菌落，接种到5 毫升农杆菌液体培养基中。28°C， 200转/分，培养8小时。取培养过夜的农杆菌，按l: 40的比例稀释至20毫升农杆菌液体培养基中， 继续培养6小时，至OD6(w为0.6。经5000转/分，离心5 min，收集菌体。用侵染 液体培养基回溶沉淀，稀释至OD6W)为0.15后备用。所述农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升农杆菌基本培养基中含50毫 克利福平和50毫克卡那霉素；所述农杆菌基本培养基所含组分及配比为胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5 克/升，氯化钠10克/升的LB液体培养基，pH = 7.0;所述侵染液体培养基为MS培养基，pH = 5.2; 4、植物材料的农杆菌侵染和共培养将经预培养的子叶柄段置于上述含有农杆菌的OD,为0.15的侵染液体培养 基中，浸泡15分钟后取出。用滤纸吸干附着在植物材料表面的菌液，平铺在共培 养培养基上。25°C，暗培养2天。所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含水解乳蛋 白300毫克，硝酸银8毫克，蔗糖40毫克，琼脂10毫克，乙酰丁香酮100毫摩 尔和6 —苄基腺嘌呤3毫克、萘乙酸2毫克;pH-5.2;所述共培养基本培养基为MS培养基；5、前培养将共培养2天的子叶柄段取出，置于三角瓶中。用无菌水冲洗3 —5次后，再 用含羧苄青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次，每次10分钟；用含羧苄青霉素500 毫克/升的MS液体培养基冲洗l一2次；将叶片取出，用滤纸吸干水分，超净工作 台中吹干。平铺于筛选培养基上；培养条件光照强度5000勒克斯，光照时间16 小时/天，温度20—25'C。培养3天。所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含水解乳蛋12 白300毫克，硝酸银8毫克，蔗糖40毫克，琼脂10毫克，羟苄青霉素250毫克， 和6 —苄基腺嘌呤3毫克、萘乙酸2毫克，pH=5.8; 6、筛选培养将前培养7天的子叶柄段取出，转移至筛选培养基上。培养条件光照强度5000 勒克斯，光照时间16小时/天，^度2(TC。 21天继代一次。所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300 毫克，硝酸银8毫克，蔗糖40毫克，琼脂10毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡 那霉素10毫克/升和6—苄基腺嘌呤0.1毫克、萘乙酸1毫克，羧苄青霉素250毫 克/升，卡那霉素25毫克/升，pH=5.8; 所述筛选基本培养基为MS培养基； 7、壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接 种到壮苗培养基中培养21天； 所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖40毫克， 琼脂10毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡那霉素5毫克/升，pH=5.8; 所述壮苗基本培养基为1/2MS培养基； 8、生根培养剪取经壮苗培养3.5-6厘米的试管苗，从培养基中取出，洗去附着的培养基， 转移至荷格兰特液体培养基中进行水培生根培养其培养条件为以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22°C，光照16小时/天，湿度85%; 9、移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米时取出，移栽到苗圃基质中，进行移 栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯 薄膜覆盖，保持湿度90 — 95%，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格 兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80%，温度20 一30'C，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素， 进行速生培养，完成印度芥菜转基因苗的培养。
实施例3:农杆菌介导的高效印度芥菜遗传转化 1、初代培养物的建立取印度芥菜成熟种子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1%氯化汞中浸泡8 分钟。无菌水冲洗3 — 5遍，灭菌滤纸吸干水分；置于种子萌发培养基上培养15 天。培养条件为光照强度为3000勒克斯，光照时间16小时/天，温度25'C。所述种子萌发培养基为MS培养基；2、 预培养以经萌发培养的印度芥菜幼苗为材料，切取长约3平方毫米子叶作为外植体，平铺在预培养培养基上，进行预培养2天半；培养条件为光照强度为5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20—25r。所述预培养培养基所含组分及配比为每升增殖基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0毫克，蔗糖10毫克，琼脂5毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和 6 —苄基腺嘌呤2毫克、萘乙酸5毫克，pH=5.8; 所述预培养基本培养基为MS培养基；3、 农杆菌的活化分别挑取带有目的基因的双子叶植物表达载体的农杆菌的单菌落，接种到5 毫升农杆菌液体培养基中。28°C， 200转/分，培养8小时。取培养过夜的农杆菌，按l: 40的比例稀释至20毫升农杆菌液体培养基中， 继续培养5.5小时，至OD6oo为0.6。经5000转/分，离心5 min，收集菌体。用侵 染液体培养基回溶沉淀，稀释至OD6oo为0.15后备用。所述农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升农杆菌基本培养基中含50毫 克利福平和50毫克卡那霉素；所述农杆菌基本培养基所含组分及配比为胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5 克/升，氯化钠10克/升的LB液体培养基，pH = 7.0;所述侵染液体培养基为MS培养基，pH=5.2; 4、植物材料的农杆菌侵染和共培养将预培养2天的子叶置于上述含有农杆菌的OD6(K)为0.15的侵染液体培养基 中，浸泡5分钟后取出。用滤纸吸干附着在植物材料表面的菌液，平铺在共培养 培养基上。25°C，暗培养2天。所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含水解乳蛋
白300毫克，硝酸银4毫克，蔗糖10毫克，琼脂5毫克，乙酰丁番酮100毫摩尔 和6 —苄基腺嘌呤2毫克、萘乙酸5毫克，pH=5.2; 所述共培养基本培养基为MS培养基；5、 前培养将共培养2天的子叶取出，置于三角瓶中。用无菌水冲洗3 — 5次后，再用含 羧节青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次，每次10分钟；用含羧苄青霉素500毫 克/升的MS液体培养基冲洗l一2次；将叶片取出，用滤纸吸干水分，超净工作台 中吹干；平铺于筛选培养基上。培养条件光照强度4000勒克斯，光照时间16小 时/天，温度20—25X:;培养7天。所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银4毫克，蔗糖10毫克，琼脂5毫克，乙酰丁香酮(权利要求 中为羟苄青霉素250毫克，和6 —苄基腺嘌呤2毫克、萘乙酸5毫克，pH=5.8;6、 筛选培养将经前培养的子叶取出，转移至筛选培养基上；培养条件光照强度4000勒 克斯，光照时间16小时/天，温度23。C; 21天继代一次。所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0毫克，蔗糖10毫克，琼脂5毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡那 霉素5毫克和6—苄基腺嘌呤5毫克、萘乙酸0.1毫克，羧苄青霉素250毫克/升， 卡那霉素10毫克/升,pH=5.8;所述筛选基本培养基为MS培养基； 7、壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接 种到壮苗培养基中培养23天；所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖IO毫克，琼脂5毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡那霉素25毫克/升，pH=5.8; 所述壮苗基本培养基为1/2MS培养基； 8、生根培养剪取经壮苗培养6-8厘米的试管苗，从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培生根培养；其培养条件为以泡沫板作为幼 苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生;
每5天更换一次荷格兰特液体培养基；23 °C，光照16小时/天，湿度83%; 9、移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米时取出，移栽到苗圃基质中，进行移 栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯 薄膜覆盖，保持湿度卯一95%，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格 兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80。/。，温度20 一30'C，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素， 进行速生培养，完成印度芥菜转基因苗的培养。实施例4:农杆菌介导的印度芥菜遗传转化 1、初代培养物的建立取印度芥菜成熟种子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1%氯化汞中浸泡8 分钟。无菌水冲洗3 — 5遍，灭菌滤纸吸干水分；置于种子萌发培养基上培养5天 (或9天)。培养条件为光照强度为5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度 2(TC。所述种子萌发培养基为MS培养基；2、 预培养以经萌发培养的印度芥菜幼苗为材料，切取长约5 — 7毫米下胚轴段作为外植 体，平铺在预培养培养基上，进行预培养2天。培养条件为光照强度为3000勒 克斯，光照时间16小时/天，温度20 — 25'C。所述预培养培养基所含组分及配比为每升增殖基本培养基中含水解乳蛋白 300毫克，硝酸银8(0或5)毫克，蔗糖30毫克，琼脂6毫克，乙酰丁香酮100毫 摩尔和6 —苄基腺嘌呤8(0.1或1)毫克、萘乙酸4(8或0.1)毫克，pH=5.8;所述预培养基本培养基为MS培养基；3、 农杆菌的活化分别挑取带有目的基因的双子叶植物表达载体的农杆菌的单菌落，接种到5 毫升农杆菌液体培养基中；28°C, 200转/分，培养8小时。取培养过夜的农杆菌，按h 40的比例稀释至20毫升农杆菌液体培养基中， 继续培养5小时，至OD6oo为0.6;经5000转/分，离心5 min,收集菌体；用侵染 液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD60Q为(U5后备用。所述农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升农杆菌基本培养基中含50毫 克利福平和50毫克卡那霉素；所述农杆菌基本培养基所含组分及配比为胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5 克/升，氯化钠10克/升的LB液体培养基，pH = 7.0;所述侵染液体培养基为MS培养基，pH = 5.2; 4、植物材料的农杆菌侵染和共培养将经预培养的下胚轴段置于上述含有农杆菌的OD6oo为0.15的侵染液体培养 基中，浸泡8分钟后取出。用滤纸吸干附着在植物材料表面的菌液，平铺在共培 养培养基上;25"C，暗培养2天。所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含水解乳蛋 白300毫克，硝酸银3(7或0)毫克，蔗糖25毫克，琼脂7毫克，乙酰丁香酮100 毫摩尔和6 —苄基腺嘌呤0.1(4、 1或8)毫克、萘乙酸1(0.5、 0.1或8)毫克，pH =5.2;所述共培养基本培养基为MS培养基；5、 前培养将经共培养的下胚轴段取出，置于三角瓶中。用无菌水冲洗3 — 5次后，再用 含羧苄青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次，每次10分钟；用含羧苄青霉素500 毫克/升的MS液体培养基冲洗l一2次；将叶片取出，用滤纸吸干水分，超净工作 台中吹干。平铺于筛选培养基上；培养条件光照强度3000勒克斯，光照时间16 小时/天，温度20—25'C;培养15天。所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含水解乳蛋 白300毫克，硝酸银8(0、 3或7)毫克，蔗糖25毫克，琼脂7毫克，羧苄青霉素 250毫克/升和6—苄基腺嘌呤0.1(1.0、4或8)毫克、萘乙酸0.5(0.1或8)毫克，pH =5.8;6、 筛选培养将经前培养的下胚轴段取出，转移至筛选培养基上。培养条件光照强度3000 勒克斯，光照时间16小时/天，温度25'C; 21天继代一次。所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300 毫克，硝酸银3(5或7)毫克，蔗糖25毫克，琼脂7毫克，羧苄青霉素250毫克/ 升，卡那霉素10毫克/升和'6—苄基腺嘌呤1.0(4或3)毫克、萘乙酸0.5(2或l)毫克， 羧苄青霉素250毫克/升，卡那霉素10毫克/升，pH=5.8; 所述筛选基本培养基为MS培养基；7、壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接 种到壮苗培养基中培养25天；所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖30毫克，琼脂7毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡那霉素10毫克/升，pH=5.8; 所述壮苗基本培养基为1/2MS培养基； 8、生根培养剪取经壮苗培养6-8厘米的试管苗，从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培生根培养；其培养条件为以泡沫板作为幼 苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生;每5天更换一次荷格兰特液体培养基；25°C，光照16小时/天，湿度80%; 9、移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米时取出，移栽到苗圃基质中，进行移 栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯 薄膜覆盖，保持湿度90—95%，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格 兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80%，温度20 一30'C，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素， 进行速生培养，完成印度芥菜转基因苗的培养。
权利要求
1、一种重金属超富集植物印度芥菜的高效农杆菌遗传转化方法，其步骤如下1)建立初代培养物—印度芥菜幼苗取印度芥菜成熟种子，用酒精进行表面消毒，之后，置于氯化汞中浸泡后取出；再进行无菌水冲洗，灭菌，并用滤纸吸干其表面水分；再置于种子萌发培养基上培养5-15天，得初代培养物—印度芥菜幼苗；其培养条件为光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述种子萌发培养基为MS培养基；2)印度芥菜幼苗的预培养将上述印度芥菜幼苗切取长5-7毫米左右的下胚轴段、3-5毫米的子叶柄段或3-5平方毫米的子叶作为外植体；将所述外植体分别平铺在预培养培养基上进行预培养2-3天，至外植体膨大；其预培养条件为光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述预培养培养基所含组分及配比为每升预培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0-8毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和6-苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述预培养基本培养基为MS培养基；3)农杆菌的活化分别挑取带有双子叶植物表达载体的农杆菌单菌落，接种到5毫升农杆菌液体培养基中培养8小时；其培养条件为28℃，200转/分；取培养过夜的农杆菌培养液，按1∶40的比例稀释至20毫升LB液体农杆菌培养基中，继续培养5-6小时，至OD600为0.6；经5000转/分，离心5min；收集菌体，用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD600为0.15侵染液体培养基；备用；所述LB液体农杆菌培养基所含组分及配比为每升LB基本培养基中含利福平50毫克和卡那霉素50毫克；所述LB基本培养基所含组分及配比为每升农杆菌基本培养基中含10克的胰蛋白胨，10克的酵母提取物，10克的氯化钠LB液体培养基，50毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH＝7.0；所述侵染液体培养基为MS培养基，pH＝5.2；4)经预培养的印度芥菜幼苗的农杆菌侵染和共培养将预培养2-3天的印度芥菜幼苗的下胚轴段、子叶柄段和子叶分别置于上述含有农杆菌的OD600为0.15的侵染液体培养基中，浸泡5-15分钟后取出；用滤纸吸干附着其表面的菌液，平铺在共培养培养基上，25℃下，暗培养2天；所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0-8毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和6-苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；所述共培养基本培养基为MS培养基；5)前培养将步骤4)培养后的印度芥菜幼苗的下胚轴段、子叶柄段和子叶取出，分别置于三角瓶中；用无菌水冲洗3-5次后，再用含羧苄青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次，每次10分钟；用含羧苄青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗1-2次；将叶片取出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹干；平铺于前培养基上培养3-15天；其培养条件光照强度3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0-8毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克/升和6-苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述前培养基本培养基为MS培养基；6)筛选培养将经前培养3-15天的印度芥菜幼苗的下胚轴段、子叶柄段和子叶取出，转移至筛选培养基上；培养条件光照强度3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；21天继代一次，得试管丛生芽苗；所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，硝酸银0-8毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克/升，卡那霉素5-25毫克/升和6-苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述筛选基本培养基为MS培养基；7)壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到壮苗培养基中培养21-25天，得试管苗；所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克/升和卡那霉素5-25毫克/升，pH＝5.8；所述壮苗基本培养基为MS培养基；8)水培生根培养剪取经壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培生根培养；其培养条件为以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22-25℃，光照16小时/天，湿度80-85％；9)移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1∶1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95％，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80％，温度20-30℃，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成印度芥菜转基因苗的培养。
2、 按权利要求l所述的方法，其特征在于，所述歩骤l)中所述的种子萌发培 养中所述的培养时间为5 — 9天。
3、 按权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤2)，步骤4)，步骤5) 和步骤6)中所述的预培养培养基，共培养培养基和筛选培养基中所述的硝酸银为3 一7毫克/升，蔗糖为25—40毫克/升，6—苄基嘌呤为1.0—4毫克/升，萘乙酸为 0.5—2毫克/升。
4、 按权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中所述前培养时间 为5 — 10天。
全文摘要
一种重金属超富集植物印度芥菜的高效农杆菌遗传转化方法印度芥菜成熟种子经消毒处理后置于种子萌发培养基上培养至一对子叶展开时，取幼苗下胚轴段、子叶柄段或子叶接种于预培养基中培养；农杆菌侵染后置于共培养基上进行共培养，转接到前培养基上至愈伤膨大；转接到筛选培养基上得到抗性愈伤组织，并分化出抗性丛生芽；将丛生芽置于基本培养基中进行壮苗培养；转移至荷格兰特营养液中进行水培生根培养，之后再将生根的壮苗移栽到苗圃基质中进行移栽定植培养，得到转基因印度芥菜成熟植株。本方法可排除外界条件影响，四季可行，节约育苗占地，降低生产成本，而且短期内得到大量健壮转基因幼苗，满足分子生物学研究和生产应用。
文档编号C12N5/10GK101130783SQ20061011251
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月22日 优先权日2006年8月22日
发明者林 丛, 官子楸, 进 徐, 柴团耀, 璐 韩, 嵬 魏 申请人:中国科学院研究生院