专利名称：一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜遗传转化方法的建立及转基因苗的培育的制作方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域；特别涉及一种重金属超富集植物天 蓝遏蓝菜的农杆菌介导的转化以及转基因苗的培育方法。
背景技术：
天蓝遏蓝菜(caejY/Jesce/75")属于十字花科遏蓝菜属，广 泛分布于北欧，是一种Zn和Cd的超积累植物。因此天蓝遏蓝菜已成为 世界上研究植物对重金属的超累积现象的主要植物之一。天蓝遏蓝菜以 其对锌的超富集而称著，同时也是镉和镍的超累积植物。Baker和 NcGrath研究发现，土壤含Zn 444mg/kg时，天蓝遏蓝菜地上部Zn的含 量可达到土壤的16倍。有文献报道在污染地区和富含矿物质的土壤中 生长的天蓝遏蓝菜对锌、镉、镍的累计量分别达到30，000ugZngLwt， 14， OOOug Cdg—M. wt， 4700ugNig—M. wt。大多数植物累积Zn达到100ppm 时即表现中毒症状,而天蓝遏蓝菜可累积Zn达26,000ppm却未表现出任 何受伤症状(Brown et al,1995)。随着有关植物重金属富集现象数据的不 断积累，已有越来越多的研究者将研究重点转移到植物积累重金属中所 涉及的生物化学、分子生物学和植物生理学等研究领域。
拟南芥、烟草等是人们研究新功能基因的主要模式植物。然而，现 有的模式植物并不具备对重金属超富集与耐受这样的生理机能。所以， 运用分子生物学、基因组学、蛋白质组学等先进的生物学研究技术，发 展新的具有重金属超富集和耐受性的模式植物，将使这一领域的研究规 范化、深入化，研究结果可比性高，达到事半功倍的效果。
天蓝遏蓝菜虽然具备较好的重金属富集与耐受能力，而且被国内外 研究人员看好，但目前尚未出现与其转基因研究相关的报道。本发明旨 在提供一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜转基因苗培育方法，建立并基 本完善天蓝遏蓝菜的农杆菌转化体系，为其成为具有重金属超富集与耐 受的模式植物提供有效技术途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的农杆菌 介导的转化方法以及建立转基因苗的培育，以满足天蓝遏蓝菜转基因研 究和生产实际应用的需求。
技术方案如下
本发明提供了重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的根癌农杆菌介导的遗 传转化及其转基因苗的培养方法，其步骤如下 1)建立初代培养物一天蓝遏蓝菜幼苗
取天蓝遏蓝菜成熟种子，用酒精进行表面消毒，置于氯化汞中浸泡 后取出；再进行无菌水冲洗，灭菌，并用滤纸吸干其表面水分；
再置于种子萌发培养基上培养7 - 15天，得初代培养物一天蓝遏蓝 菜幼苗；其培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯，光照时间16 小时/天，温度20-25。C;
所述种子萌发培养基为MS培养基；
2) 天蓝遏蓝菜丛生芽的培养
将上述天蓝遏蓝菜幼苗置于分化培养基上进行丛生芽的分化培养 10-14天，至茎节处分化出丛状小苗即丛生芽；其培养条件为光照强 度为3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20- 25°C;
所述分化培养基所含组分及配比为每升分化培养基中含水解乳蛋 白300毫克，维生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖10-40毫 克，琼脂5-IO毫克，以及6-节基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各 0.1 - 8毫克，pH=5.8;
所述分化基本培养基为MS培养基；
3) 天蓝遏蓝菜丛生芽的预培养
将以上所述天蓝遏蓝菜丛生芽平铺在预培养培养基上进行预培养2 -3天；其预培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯，光照时间 16小时/天，温度20- 25。C;
所述预培养培养基所含组分及配比为每升预培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖 10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素、6-卡基腺噤呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH=5.2;
所述预培养基本培养基为MS培养基；4)农杆菌的活化
分别挑取带有双子叶植物表达载体的农杆菌单菌落，接种到5毫升 LB农杆菌液体培养基中培养8小时；其培养条件为28。C, 200转/分；
取培养过夜的LB农杆菌培养液，按1: 40的比例稀释至20毫升LB 液体农杆菌培养基中，继续培养5-6小时，至OD6o。为0.6;经5000 转/分，离心5 min;收集菌体，用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至 OD6。。为0.15侵染液体培养基；备用；
所述LB农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升LB农杆菌液体 培养基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化钠，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH = 7.0;
所述侵染液体培养基为液体MS培养基，pH = 5.2; 5)经预培养的天蓝遏蓝菜丛生芽的农杆菌侵染和共培养
将预培养2-3天的天蓝遏蓝菜丛生芽置于上述含有农杆菌的OD600 为0.15的侵染液体培养基中，浸泡5-15分钟后取出；用滤纸吸干附着 其表面的菌液，平铺在共培养培养基上，25。C下，暗培养2天；
所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖 10-40毫克，琼脂5-IO毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素、6-千基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH=5.2;
所述共培养基本培养基为MS培养基；
6)前培养
将步骤5)培养后的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，分别置于三角瓶中；用 无菌水冲洗3-5次后，再用含羧千青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3 次，每次IO分钟；用含羧千青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗1 -2次；将丛生芽取出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹干；平铺于 前培养基上培养3-15天；其培养条件光照强度3000 - 5000勒克斯， 光照时间16小时/天，温度20-25。C;
所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖 10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧千青霉素250毫克和激动素、6-苄基 腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH=5.8; 所述前培养基本培养基为MS培养基；7)筛选培养
将经前培养3-15天的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，转移至筛选培养基 上；培养条件光照强度3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温 度20- 25。C; 18天继代一次，得试管丛生芽苗；
所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解 乳蛋白300毫克，维生素B0-8毫克，肌醇50- 300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克，卡那霉素5-50毫克 和激动素、6-节基腺噤呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH =5.8;
所述筛选基本培养基为MS培养基； 8)壮苗培养
将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的 茎段，接种到壮苗培养基中培养18-35天，得试管苗；
所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖 10-40毫克，琼脂5-IO毫克，肌醇50- 300毫克，羧千青霉素250 毫克和卡那霉素5-50毫克，pH=5.8;
所述壮苗基本培养基为MS培养基；
9) 生根培养
将经过壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，接种到生根培养基中培养18 -25天，得生根苗；从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格 兰特液体培养基中进行水培继续生根培养；其培养条件为以泡沫板作
为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光 导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22- 25°C,光 照16小时/天，湿度80- 85%;
所述生根培养基所含组分及配比为每升生根基本培养基中含蔗糖 10-40毫克，琼脂5-10毫克，肌醇50- 300毫克，羧千青霉素250 毫克和卡那霉素5-50毫克，pH=5.8;
所述生根基本培养基为1/2MS培养基；
10) 移栽定植
待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭 石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90- 95%，注意通风；每5天喷水1次， 14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持温室内湿度80%,温度20- 30。C,每天喷水3次，14天喷施1次 荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成天蓝遏 蓝菜转基因苗的培养。
所述步骤l)中所述的种子萌发培养中所述的培养时间为5-9天时， 效果较佳。
所述步骤3),步骤5),步骤6)和步骤7)中所述的预培养培养基， 前培养培养基，共培养培养基和筛选培养基中所述的蔗糖为25 - 40毫 克/升，激动素为1.0-5毫克/升，6-苄基嘌呤为1.0-4毫克/升，萘乙酸 为0.5-2毫克/升时，效果较佳。
所述步骤6)中所述前培养时间为5-IO天时，效果较佳。
采用本发明方法进行稳定的重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的农杆菌 转化方法和转基因苗的培养过程，可以在短期内得到大量健壮的阳性转 基因幼苗，转化率高达50%,受外界环境影响小，四季皆可进行。同时 还具备节约育苗占地、降低生产成本等优点。植物组织培养技术是利用
细胞全能性，采用植物体上的细胞团或一块组织，通过人为条件控制， 使之形成大量植抹，并且保存了母体的全部优良性状，且遗传性状稳定。 通过这种方法得到的大量健壮天蓝遏蓝菜转基因试管苗，生长速度和生 物量没有变化，完全可以满足分子生物学研究和生产应用。
具体实施例方式
下面结合农杆菌介导的天蓝遏蓝菜遗传转化实施例进一步描述本发
明
实施例1:农杆菌介导的高效的天蓝遏蓝菜遗传转化以及转基因苗的培 育
1、建立初代培养物一天蓝遏蓝菜幼苗
取天蓝遏蓝菜成熟种子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.P/。氯化 汞中浸泡8分钟。无菌水冲洗3-5遍，灭菌滤纸吸干水分；置于种子 萌发培养基上培养7天。培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20- 25。C。所述种子萌发培养基为MS培养 基；
2、 天蓝遏蓝菜丛生芽的培养
将上述天蓝遏蓝菜幼苗置于分化培养基上进行丛生芽的分化培养 10-14天，至茎节处分化出丛状小苗即丛生芽；其培养条件为光照强 度为3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20- 25°C;
所述分化培养基所含组分及配比为每升分化培养基中含水解乳蛋 白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼脂6 毫克，以及6-千基腺嘌呤2毫克，萘乙酸0.5毫克，pH=5.8;
所述分化基本培养基为MS培养基；
3、 天蓝遏蓝菜丛生芽的预培养
将以上所述天蓝遏蓝菜丛生芽平铺在预培养培养基上进行预培养2 -3天；其预培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯，光照时间 16小时/天，温度20- 25。C;
所述预培养培养基所含组分及配比为每升预培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼脂6毫克，乙 酰丁香酮100毫摩尔和6-千基腺噪呤6毫克，萘乙酸2毫克，pH=5.2;
所述预培养基本培养基为MS培养基；
4、 农杆菌的活化
分别挑取带有目的基因Bjcat5的双子叶植物表达载体的农杆菌的单 菌落，接种到5毫升LB农杆菌液体培养基中；28°C, 200转/分，培养 8小时。
取培养过夜的农杆菌，按l: 40的比例稀释至20毫升LB农杆菌液 体培养基中，继续培养5小时，至OD6。o为0.6;经5000转/分，离心5 min,收集菌体；用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至0D6。。为0.15后 备用。
所述LB农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升LB农杆菌液体 培养基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化钠，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH = 7.0;
所述侵染液体培养基为MS培养基，pH = 5.2; 5、经预培养的天蓝遏蓝菜丛生芽的农杆菌侵染和共培养
将预培养2天的天蓝遏蓝菜丛生芽置于上述含有农杆菌的OD6。o为0.15的侵染液体培养基中，浸泡8分钟后取出；用滤纸吸干附着其表面 的菌液，平铺在共培养培养基上，25。C下，暗培养2天；
所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 琼脂6毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和6-苄基腺嘌呤6毫克，萘乙酸2 毫克，pH=5.2;
所述共培养基本培养基为MS培养基；
6、 前培养
将步骤5培养后的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，分别置于三角瓶中；用无 菌水冲洗3 - 5次后，再用含羧卡青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次， 每次10分钟；用含羧爷青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗2次； 将丛生芽取出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹干；平铺于前培养基 上；其培养条件光照强度3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天， 温度20-25°C;
所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 琼脂6毫克，羧节青霉素250毫克和6-苄基腺嘌呤6毫克，萘乙酸2毫 克，pH=5.8;
所述前培养基本培养基为MS培养基；
7、 筛选培养
将经前培养天蓝遏蓝菜丛生芽取出，转移至筛选培养基上；培养条件 光照强度3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20- 25。C; 18 天继代一次，得试管丛生芽苗；
所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解 乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼 脂6毫克，羧节青霉素250毫克，卡那霉素25毫克和6-苄基腺嘌呤6 毫克，萘乙酸2亳克，pH=5.8;
所述筛选基本培养基为MS培养基；
8、 壮苗培养
将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的 茎段，接种到壮苗培养基中培养18-35天，得试管苗；
所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖30毫克，琼脂6毫克，肌醇200毫克，羧千青霉素250毫克和卡那霉素 25毫克，pH=5.8;
所述壮苗基本培养基为MS培养基；
9、 生根培养
将经过壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，接种到生根培养基中培养18 -25天，得生根苗；从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格 兰特液体培养基中进行水培继续生根培养；其培养条件为以泡沫板作 为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大'J、一致，尽量避免根部见光 导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22 - 25 。C，光 照16小时/天，湿度80- 85%;
所述生根培养基所含组分及配比为每升生根基本培养基中含蔗糖 30毫克，琼脂5毫克，肌醇100毫克，羧千青霉素250毫克/升和卡那 霉素20毫克/升，pH=5.8;
所述生根基本培养基为1/2MS培养基；
10、 移栽定植
待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭 石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后， 用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90- 95%，注意通风；每5天喷水1次， 14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持温室内湿度80%,温度20- 30。C,每天喷水3次，14天喷施1次 荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成天蓝遏 蓝菜转基因苗的培养。
实施例2:农杆菌介导的高效的天蓝遏蓝菜遗传转化以及转基因苗的培 育
1、建立初代培养物一天蓝遏蓝菜幼苗
取天蓝遏蓝菜成熟种子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1%氯化 汞中浸泡8分钟。无菌水冲洗3-5遍，灭菌滤纸吸干水分；置于种子 萌发培养基上培养7天。培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯， 光照时间16小时/天，温度20- 25。C。所述种子萌发培养基为MS培养 基；2、 天蓝遏蓝菜丛生芽的培养
将上述天蓝遏蓝菜幼苗置于分化培养基上进行丛生芽的分化培养 10-14天，至茎节处分化出丛状小苗即丛生芽；其培养条件为光照强 度为3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20- 25。C;
所述分化培养基所含组分及配比为每升分化培养基中含水解乳蛋 白300毫克，维生素B 5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼脂6 毫克，以及6-苄基腺嘌呤2毫克，萘乙酸0.5毫克，pH=5.8;
所述分化基本培养基为MS培养基；
3、 天蓝遏蓝菜丛生芽的预培养
将以上所述天蓝遏蓝菜丛生芽平铺在预培养培养基上进行预培养2 -3天；其预培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯，光照时间 16小时/天，温度20- 25。C;
所述预培养培养基所含组分及配比为每升预培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼脂6毫克，乙 酰丁香酮100毫摩尔和激动素5毫克，6-节基腺噤呤2毫克，萘乙酸3 亳克，pH=5.2;
所述预培养基本培养基为MS培养基；
4、 农杆菌的活化
分别挑取带有目的基因Bjcat5的双子叶植物表达载体的农杆菌的单 菌落，接种到5毫升LB农杆菌液体培养基中；28°C， 200转/分，培养 8小时。
取培养过夜的农杆菌，按l: 40的比例稀释至20毫升LB农杆菌液 体培养基中，继续培养5小时，至OD6oo为0.6;经5000转/分，离心5 min,收集菌体；用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD6Q()为0.15后 备用。
所述LB农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升LB农杆菌液体 培养基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化钠，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH-7.0;
所述侵染液体培养基为MS培养基，pH = 5.2;
5、 经预培养的天蓝遏蓝菜丛生芽的农杆菌侵染和共培养 将预培养2天的天蓝遏蓝菜丛生芽置于上述含有农杆菌的OD6。o为
0.15的侵染液体培养基中，浸泡8分钟后取出；用滤纸吸干附着其表面的菌液，平铺在共培养培养基上，25。C下，暗培养2天；
所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含
水解乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，
琼脂6毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素5毫克，6-苄基腺嘌呤2
毫克，萘乙酸3毫克，pH=5.2;
所述共培养基本培养基为MS培养基；
6、 前培养
将步骤5培养后的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，分别置于三角瓶中；用无 菌水冲洗3 - 5次后，再用含羧节青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次， 每次10分钟；用含羧卡青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗2次； 将丛生芽取出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹干；平铺于前培养基 上；其培养条件光照强度3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天， 温度20-25°C;
所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 琼脂6毫克，羧千青霉素250毫克和激动素5毫克，6-苄基腺嘌呤2毫 克，萘乙酸3毫克，pH=5.8;
所述前培养基本培养基为MS培养基；
7、 筛选培养
将经前培养天蓝遏蓝菜丛生芽取出，转移至筛选培养基上；培养条件 光照强度3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25°C; 18 天继代一次，得试管丛生芽苗；
所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解 乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼 脂6毫克，羧苄青霉素250毫克，卡那霉素25毫克和激动素5毫克， 6-卡基腺嘌呤2毫克，萘乙酸3毫克，pH=5.8; 所述筛选基本培养基为MS培养基； 8、壮苗培养
将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的 茎段，接种到壮苗培养基中培养18-35天，得试管苗；
所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖 30毫克，琼脂6毫克，肌醇200毫克，羧苄青霉素250毫克和卡那霉素25毫克，pH=5.8;
所述壮苗基本培养基为MS培养基； 9、生4艮培养
将经过壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，接种到生根培养基中培养18 -25天，得生根苗；从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格 兰特液体培养基中进行水培继续生根培养；其培养条件为以泡沫板作 为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光 导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22- 25°C,光照 16小时/天，湿度80- 85%;
所述生根培养基所含组分及配比为每升生根基本培养基中含蔗糖 30毫克，琼脂5毫克，肌醇100毫克，羧苄青霉素250毫克/升和卡那 霉素20毫克/升，pH=5.8;
所述生根基本培养基为1/2MS培养基； 10、移栽定柏—
待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭 石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后， 用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90- 95%,注意通风；每5天喷水1次， 14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持温室内湿度80%,温度20- 30°C，每天喷水3次，14天喷施1次 荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成天蓝遏 蓝菜转基因苗的培养。
实施例3: 农杆菌介导的天蓝遏蓝菜遗传转化以及转基因苗的培育
1、 建立初代培养物一天蓝遏蓝菜幼苗
取天蓝遏蓝菜成熟种子，70%酒精表面消毒30秒后，置于0.1%氯化 汞中浸泡8分钟。无菌水沖洗3-5遍，灭菌滤纸吸干水分；置于种子 萌发培养基上培养7天。培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯， 光照时间16小时/天，温度20-25°C。所述种子萌发培养基为MS培养 基；
2、 天蓝遏蓝菜丛生芽的培养
将上述天蓝遏蓝菜幼苗置于分化培养基上进行丛生芽的分化培养10-14天，至茎节处分化出丛状小苗即丛生芽；其培养条件为光照强 度为3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20- 25°C;
所述分化培养基所含组分及配比为每升分化培养基中含水解乳蛋 白300毫克，维生素B 5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼脂6 毫克，以及6-卡基腺噤呤2毫克，萘乙酸0.5毫克，pH=5.8;
所述分化基本培养基为MS培养基；
3、 天蓝遏蓝菜丛生芽的预培养
将以上所述天蓝遏蓝菜丛生芽平铺在预培养培养基上进行预培养2 -3天；其预培养条件为光照强度为3000- 5000勒克斯，光照时间 16小时/天,温度20-25。C;
所述预培养培养基所含组分及配比为每升预培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼脂6毫克，乙 酰丁香酮100毫摩尔和6-千基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.2毫克，pH-5.2;
所述预培养基本培养基为MS培养基；
4、 农杆菌的活化
分别挑取带有目的基因Bjcat5的双子叶植物表达载体的农杆菌的单 菌落，接种到5毫升LB农杆菌液体培养基中；28°C, 200转/分，培养 8小时。
取培养过夜的农杆菌，按l: 40的比例稀释至20毫升LB农杆菌液 体培养基中，继续培养5小时，至OD6。。为0.6;经5000转/分，离心5 min，收集菌体；用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD,为0.15后 备用。
所述LB农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升LB农杆菌液体 培养基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，IO克的氯化钠，50 毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH = 7.0;
所述侵染液体培养基为MS培养基，pH = 5,2; 5、经预培养的天蓝遏蓝菜丛生芽的农杆菌侵染和共培养
将预培养2天的天蓝遏蓝菜丛生芽置于上述含有农杆菌的OD,为 0.15的侵染液体培养基中，浸泡8分钟后取出；用滤纸吸干附着其表面 的菌液，平铺在共培养培养基上，25。C下，暗培养2天；
所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼脂6毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和6-卡基腺嘌呤1毫克，萘乙酸 0.2毫克，pH=5.2;
所述共培养基本培养基为MS培养基；
6、 前培养
将步骤5培养后的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，分别置于三角瓶中；用无 菌水冲洗3 - 5次后，再用含羧千青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次， 每次10分钟；用含羧节青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗2次； 将叶片取出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹千；平铺于前培养基上； 其培养条件光照强度3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度 20-25。C;
所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含 水解乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克， 琼脂6毫克，羧千青霉素250毫克和6-卡基腺嘌呤l毫克，萘乙S臾0.2 毫克，pH=5.8;
所述前培养基本培养基为MS培养基；
7、 筛选培养
将经前培养天蓝遏蓝菜丛生芽取出，转移至筛选培养基上；培养条件 光照强度3000- 5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20- 25。C; 18 天继代一次，得试管丛生芽苗；
所述篩选培养基所含組分及配比为每升筛选基本培养基中含水解 乳蛋白300毫克，维生素B5毫克，肌醇200毫克，蔗糖30毫克，琼 脂6毫克，羧千青霉素250毫克，卡那霉素25毫克和6-千基腺嘌呤1 毫克，萘乙酸0.2毫克，pH=5.8;
所述筛选基本培养基为MS培养基； 8、壮苗培养
将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的 茎段，接种到壮苗培养基中培养18-35天，得试管苗；
所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖 30毫克，琼脂6毫克，肌醇200毫克，羧苄青霉素250毫克和卡那霉素 25毫克，pH=5.8;
所述壮苗基本培养基为MS培养基；
9、生根培养将经过壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，接种到生根培养基中培养18 -25天，得生根苗；从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格 兰特液体培养基中进行水培继续生根培养；其培养条件为以泡沫板作
为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光 导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22- 25 。C，光 照16小时/天，湿度80 - 85%;
所述生根培养基所含组分及配比为每升生根基本培养基中含蔗糖 30毫克，琼脂5毫克，肌醇100毫克，羧苄青霉素250毫克/升和卡那 霉素20毫克/升，pH=5.8;
所述生根基本培养基为1/2MS培养基； 10、移栽定植
待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗 圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1:1花土和蛭 石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后， 用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95%,注意通风；每5天喷水1次， 14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再 保持温室内湿度80%，温度20- 30°C,每天喷水3次，14天喷施1次 荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成天蓝遏 蓝菜转基因苗的培养。
权利要求
1、一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜遗传转化方法的建立及转基因苗的培育，其步骤如下1)建立初代培养物-天蓝遏蓝菜幼苗取天蓝遏蓝菜成熟种子，用酒精进行表面消毒，之后，置于氯化汞中浸泡后取出；再进行无菌水冲洗，灭菌，并用滤纸吸干其表面水分；再置于种子萌发培养基上培养7-15天，得初代培养物-天蓝遏蓝菜幼苗；其培养条件为光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述种子萌发培养基为MS培养基；2)天蓝遏蓝菜丛生芽的培养将上述天蓝遏蓝菜幼苗置于分化培养基上进行丛生芽的分化培养10-14天，至茎节处分化出丛状小苗即丛生芽；其培养条件为光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述分化培养基所含组分及配比为每升分化培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，以及6-苄基腺嘌呤、萘乙酸两种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述分化基本培养基为MS培养基；3)天蓝遏蓝菜丛生芽的预培养将以上所述天蓝遏蓝菜丛生芽平铺在预培养培养基上进行预培养2-3天；其预培养条件为光照强度为3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述预培养培养基所含组分及配比为每升预培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；所述预培养基本培养基为MS培养基；4)农杆菌的活化分别挑取带有目的基因Bjcat5的双子叶植物表达载体的农杆菌的单菌落，接种到5毫升LB农杆菌液体培养基中培养8小时；其培养条件为28℃，200转/分；取培养过夜的LB农杆菌培养液，按1∶40的比例稀释至20毫升LB液体农杆菌培养基中，继续培养5-6小时，至OD600为0.6；经5000转/分，离心5min；收集菌体，用侵染液体培养基悬浮沉淀，稀释至OD600为0.15侵染液体培养基；备用；所述LB农杆菌液体培养基所含组分及配比为每升LB农杆菌液体培养基中含10克的胰蛋白胨，5克的酵母提取物，10克的氯化钠，50毫克的利福平和50毫克的卡那霉素；pH＝7.0；所述侵染液体培养基为MS培养基，pH＝5.2；5)经预培养的天蓝遏蓝菜丛生芽的农杆菌侵染和共培养将预培养2-3天的天蓝遏蓝菜丛生芽置于上述含有农杆菌的OD600为0.15的侵染液体培养基中，浸泡5-15分钟后取出；用滤纸吸干附着其表面的菌液，平铺在共培养培养基上，25℃下，暗培养2天；所述共培养培养基所含组分及配比为每升共培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，乙酰丁香酮100毫摩尔和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.2；所述共培养基本培养基为MS培养基；6)前培养将步骤5)培养后的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，分别置于三角瓶中；用无菌水冲洗3-5次后，再用含羧苄青霉素500毫克/升的无菌水冲洗3次，每次10分钟；用含羧苄青霉素500毫克/升的MS液体培养基冲洗1-2次；将丛生芽取出，用滤纸吸干水分，超净工作台中吹干；平铺于前培养基上培养3-15天；其培养条件光照强度3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；所述前培养培养基所含组分及配比为每升前培养基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述前培养基本培养基为MS培养基；7)筛选培养将经前培养3-15天的天蓝遏蓝菜丛生芽取出，转移至筛选培养基上；培养条件光照强度3000-5000勒克斯，光照时间16小时/天，温度20-25℃；18天继代一次，得试管丛生芽苗；所述筛选培养基所含组分及配比为每升筛选基本培养基中含水解乳蛋白300毫克，维生素B 0-8毫克，肌醇50-300毫克，蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，羧苄青霉素250毫克，卡那霉素5-50毫克和激动素、6-苄基腺嘌呤、萘乙酸三种植物生长激素各0.1-8毫克，pH＝5.8；所述筛选基本培养基为MS培养基；8)壮苗培养将经过筛选培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到壮苗培养基中培养18-35天，得试管苗；所述壮苗培养基所含组分及配比为每升壮苗基本培养基中含蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，肌醇50-300毫克，羧苄青霉素250毫克和卡那霉素5-50毫克，pH＝5.8；所述壮苗基本培养基为MS培养基；9)生根培养将经过壮苗培养3.5-8厘米的试管苗，接种到生根培养基中培养18-25天，得生根苗；从培养基中取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培继续生根培养；其培养条件为以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22-25℃，光照16小时/天，湿度80-85％；所述生根培养基所含组分及配比为每升生根基本培养基中含蔗糖10-40毫克，琼脂5-10毫克，肌醇50-300毫克，羧苄青霉素250毫克和卡那霉素5-50毫克，pH＝5.8；所述生根基本培养基为1/2MS培养基；10)移栽定植待经水培生根培养至根长不少于5厘米的水培生根取出，移栽到苗圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1∶1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95％，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80％，温度20-30℃，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成天蓝遏蓝菜转基因苗的培养。
2、 按权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤l)中所述的种 子萌发培养中所述的培养时间为5-9天。
3、 按权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤3),步骤5)， 步骤6)和步骤7)中所述的预培养培养基，前培养培养基，共培养培养 基和筛选培养基中所述的维生素B为3-7毫克/升，蔗糖为25 - 40毫 克/升，激动素为0.1-8毫克/升，6-苄基腺嘌呤为l-4毫克/升，萘乙 酸为0.1-8毫克/升。
4、 按权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤6)中所述前 培养时间为5 - 10天。
全文摘要
一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的农杆菌介导的转基因方法及其转基因苗的培养方法天蓝遏蓝菜成熟种子经消毒处理后置于种子萌发培养基上发芽后转移至分化培养基培养至丛生芽生成并接种于预培养基中培养；农杆菌侵染后置于共培养基上进行共培养，转接到前培养基上至丛生芽增生；转接到筛选培养基上分化出抗性丛生芽；将丛生芽置于基本培养基中进行壮苗培养；转移至生根培养基进行初步生根培养后转移至荷格兰特营养液中水培继续生根培养，之后再将生根的壮苗移栽到苗圃基质中进行移栽定植培养，得到转基因天蓝遏蓝菜成熟植株。本方法可排除外界条件影响，四季可行，节约育苗占地，降低生产成本，而且短期内得到大量健壮转基因幼苗，满足分子生物学研究和生产应用。
文档编号C12N15/09GK101302507SQ20071009905
公开日2008年11月12日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者林 丛, 官子楸, 进 徐, 柴团耀, 璐 韩, 嵬 魏 申请人:中国科学院研究生院